异叶败酱提取物对白血病细胞体外抑制作用的实验研究

刘 俐，穆丽华，刘 屏

（1.山西中医学院，山西 太原 030024；2.解放军总医院药理药学研究室，北京 100853）

异叶败酱提取物对白血病细胞体外抑制作用的实验研究

刘 俐1,2，穆丽华2，刘 屏2

（1.山西中医学院，山西 太原 030024；2.解放军总医院药理药学研究室，北京 100853）

目的：研究异叶败酱提取物对白血病细胞体外增殖的毒性抑制作用。方法：提取异叶败酱浸膏，通过硅胶柱分离纯化异叶败酱中的单体化合物，选择白血病细胞株HL-60、K562、Jurkat为实验对象，与不同浓度的异叶败酱提取物及分离得到的单体化合物共同培养，采用CCK-8法检测其对白血病细胞体外增殖的影响，并通过流式细胞仪检测化合物3对K562细胞凋亡和周期的影响。结果：异叶败酱提取物和单体化合物均对白血病细胞有一定的毒性抑制作用，并且抑制作用与药物浓度有依赖关系。当不同浓度的化合物3作用于K562细胞后，K562细胞出现不同程度的凋亡，细胞早期凋亡率明显上升，与对照组相比具有显著性差异（P ＜ 0.01）；细胞周期G0/G1期所占比率由42.34%增至59.48%和64.72%，与对照组相比具有显著性差异（P ＜ 0.01）。结论：异叶败酱提取物对白血病细胞具有明显的体外增殖毒性抑制作用，从中分离得到的环烯醚萜类化合物3能够诱导K562细胞的凋亡，并且将细胞周期阻滞在G0/G1期。异叶败酱提取物发挥抗肿瘤药理作用的物质基础很可能与其中的环烯醚萜类成分有关。

异叶败酱；白血病；细胞凋亡；环烯醚萜

白血病的发病是由于造血干细胞的恶性病变，白血病细胞在骨髓、造血组织中非正常大量增生，抑制正常造血过程，白血病的分型主要有慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、慢性粒细胞性白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）、急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）[1]。目前白血病的主要治疗方法是化疗，化学药物在治疗白血病的同时，也给患者机体造成难以逆转的伤害，给患者和患者家庭都带来了沉重的身体和精神负担。国内外研究者将目光转移到了中药上，从前人的智慧中汲取经验。中医药通过扶正祛邪辨证论治，在白血病的治疗上取得了确切的疗效[2]。异叶败酱是中药墓头回的药源植物之一[3]，临床用药也证实了墓头回对于白血病的控制作用[4]。本研究将异叶败酱粗提物和其中3个环烯醚萜类单体化合物按照不同浓度配比与人早幼粒白血病细胞（HL-60）、人慢性粒细胞白血病细胞（K562）、人急性T细胞白血病细胞（Jurkat）共同培养，以顺铂为阳性对照，通过CCK-8法评价异叶败酱提取物对细胞增殖的抑制作用，并初步探讨化合物3对K562细胞的凋亡和周期的影响。

1 材料

1.1 细胞株

人早幼粒白血病细胞（HL-60）、人慢性粒细胞白血病细胞（K562）、人急性T细胞白血病细胞（Jurkat），以上三株细胞均购于中国医学科学院肿瘤医院细胞中心。

1.2 实验药品

异叶败酱[2014年采于河南省，经中国人民解放军总医院刘萍主任药师鉴定为异叶败酱（Patrinia heterophylla Bunge）全草]；顺铂（齐鲁制药有限公司）。

1.3 实验仪器

YT-CJ-1ND超净工作台（北京亚泰科隆技术有限公司）；MCO-15ACCO2恒温培养箱（日本SANYO公司）；DT5-2离心机（北京时代北利离心机有限公司）；酶标仪（1420-012）（美国Perkin Elmer公司）；ECLIPSE TS100显微镜（日本Nikon公司）；流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4 主要试剂

石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，美国HyClone公司）；二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司）；CCK-8试剂盒（Biosharp生物科技公司）；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（凯基生物科技发展有限公司）。

2 方法

2.1 墓头回粗提物和单体化合物的制备

将干燥的异叶败酱全草粉碎，乙醇加热50 ℃回流提取。提取液过滤，减压浓缩，得到异叶败酱总提取物浸膏。将上述浸膏悬浮在蒸馏水中，依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。收集有机相并减压浓缩，得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位浸膏。将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇-水系统为流动相，梯度洗脱，得到馏分Y-1 ～ Y-95，合并馏分Y-12 ～ Y-15（氯仿 : 甲醇 = 30 : 1），以石油醚 : 丙酮（3 : 1）等度洗脱得化合物1；合并馏分Y-16 ～ Y-18（氯仿 : 甲醇 = 30 : 1），以石油醚 : 丙酮（3 : 1）等度洗脱得到化合物2和化合物3。

2.2 细胞培养

HL-60、K562、Jurkat三株细胞均在15%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，37 ℃，5% CO2饱和湿度条件下培养，1 ～ 2 d传代一次。

2.3 溶液系统的配制

分别称取异叶败酱不同部位浸膏，加入DMSO溶液，使浸膏充分溶解，得到浓度为104μg·mL-1的粗提物溶液。加入完全培养基按比例稀释，在超净台中用无菌滤膜过滤，得到粗提物浓度从低到高依次为10、20、40、80、100 μg·mL-1的溶液。单体化合物溶液的配制同上。

2.4 异叶败酱对白血病细胞体外增殖的作用

将处于对数生长期的HL-60、K562、Jurkat三株细胞按照5000个/孔的数量分别接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液50 μL。恒温培养24 h后分别加入浓度为10、20、40、80、100 μg·mL-1的粗提物、单体化合物溶液及顺铂溶液50 μL。每株细胞均设置空白对照，空白对照组加入50 μL完全培养基，每组浓度梯度设置5个平行副孔。给药后置于培养箱内培养48 h。48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，轻轻振摇，使CCK-8溶液与细胞悬液充分混合。1 ～ 2 h（每株细胞时间略有差异）后在450 nm处检测OD值，计算抑制率和IC50。

2.5 化合物3对K562细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的K562细胞计数，按照1× 105的细胞数量接种于六孔板中，每孔2 mL，保证每孔细胞数目均等。分别在六个孔中加入完全培养液以及“2.3”项下配制好的化合物3溶液，使六孔板中每孔培养液中含有化合物3的的终浓度依次为0、10、20、40 μg·mL-1。将六孔板置于恒温培养箱中，48 h后终止给药。

离心收集细胞，PBS洗涤两次后悬浮于500 μL Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide染色，避光反应，在流式细胞仪上检测。

2.6 化合物3对K562细胞周期的影响

按“2.5”项下方法收集细胞后，制备细胞浓度为1×106·mL-1的单细胞悬液，4 ℃条件下用70%乙醇固定8 h，洗去固定液后加入100 μL RNase A溶液，37 ℃水浴30 min后用400 μL PI染色30 min，流式细胞仪检测。

2.7 统计学分析

采用SPSS统计软件，数据以（x± s ）表示，组间比较采用方差齐性检验和Dunnett-t检验，以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 异叶败酱对白血病细胞的体外抑制作用

3.1.1 异叶败酱粗提物对白血病细胞的抑制作用 给予细胞不同浓度的粗提物刺激后，不同细胞的生长均受到不同程度的抑制。氯仿、乙酸乙酯、水三部分对于HL-60、K562、Jurkat细胞的抑制作用较为明显，且这三部分对于细胞的抑制率均随药物浓度的增加而增强。细胞受到的抑制作用以IC50表示，详见表1。

表1 异叶败酱不同部位粗提物对白血病细胞的IC50. μg·mL-1, n = 5Tab 1 IC50of different extracts from Patrinia heterophylla Bunge. μg·mL-1, n = 5

3.1.2 单体化合物对白血病细胞的抑制作用 通过以上测试结果分析，以抗肿瘤药物顺铂作为阳性对照，化合物2、3对HL-60、K562、Jurkat三株细胞均表现出了明显的毒性抑制作用，尤其是化合物3对K562细胞株的抑制作用优于阳性药物顺铂。其它化合物对三株白血病细胞表现出不同的抑制作用，其中化合物1对HL-60细胞具有一定的抑制作用。同时，化合物对白血病细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性。细胞受到的抑制作用以IC50表示，详见表2。

表2 异叶败酱不同单体化合物对白血病细胞的IC50. μg·mL-1, n = 5Tab 2 IC50of different compounds from Patrinia heterophylla Bunge. μg·mL-1, n = 5

3.2 化合物3对K562细胞凋亡的影响

当不同浓度的化合物3作用于K562细胞48 h后，K562细胞出现不同程度的凋亡，早期凋亡率与化合物3浓度为0 μg·mL-1（对照组）相比具有显著性差异（P ＜ 0.01），详见表3。

表3 K562细胞在化合物3作用下的凋亡情况Tab 3 Apoptosis of K562 cells in the action of compound 3

3.3 化合物3对K562细胞周期的影响

加药培养48 h后，K562细胞在不同浓度药物作用下的G1期比例依次为42.34%、52.48%、59.48%、64.72%，细胞周期检测结果显示化合物3可将K562细胞的生长阻滞在G1期，与化合物3浓度为0 μg·mL-1（对照组）相比，差异具有显著性（P ＜ 0.01），同时S期所占比例相应降低。详见表4。

表4 不同浓度化合物3作用下K562的细胞周期. n = 3Tab 4 Cell cycle of K562 cells in the action of compound 3. n = 3

4 讨论

现代实验研究结果表明，有毒中药可通过抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，逆转肿瘤细胞耐药性等机制发挥抗白血病作用[5-6]。异叶败酱作为墓头回的药源植物，在临床治疗白血病方面发挥了重要的作用。败酱属植物中含有环烯醚萜类成分，环烯醚萜是一类具有环戊烷结构的单萜小分子化合物，广泛存在于龙胆科、木犀科、茜草科、玄参科等双子叶植物中，有抗炎、抗肿瘤、抑制DNA合成的生物活性[7-8]。国内外均可见环烯醚萜类成分抗肿瘤作用的报道[9-11]。程卫东等[12]研究了墓头回提取液对K562细胞增殖的影响，认为墓头回对于K562细胞有显著的抑制增殖作用，但此抑制作用是否因通过抑制酪氨酸激酶的活性产生，仍有待进一步的研究。杨波等[13]研究了墓头回中环烯醚萜酯对于小鼠S180肉瘤、H22肝癌的体内抗肿瘤作用，认为环烯醚萜酯类成分能够诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤微血管，这很可能是该类成分在体内外发挥抗肿瘤作用的机制。

本实验通过CCK-8法研究了异叶败酱粗提物以及其中3个环烯醚萜类化合物对于白血病细胞的体外毒性抑制作用，并用流式细胞仪检测了K562细胞在化合物3作用下的周期和凋亡变化。实验结果表明，异叶败酱不同部位粗提物对于肿瘤细胞的抑制作用是不同的。除正丁醇部位外，其余部位均对HL-60细胞有明显的抑制作用；乙酸乙酯部位和水部位对K562细胞毒性作用明显；只有氯仿部位对Jurkat细胞有较好的毒性抑制作用，其余各部位对其效果并不显著。而对于不同细胞来说，各个部位对于细胞抑制率的平均值也是不相同的，HL-60细胞对异叶败酱不同部位粗提物的作用比较敏感，受到的抑制作用最为明显，K562次之，Jurkat细胞所受的抑制作用最弱。细胞所受毒性作用与药物作用浓度表现出明显的剂量相关性。

单体化合物对于K562、HL60两株细胞的抑制作用更为显著，而对于Jurkat细胞的抑制作用并不理想。其中化合物3对K562的抑制作用优于阳性药顺铂。进一步研究表明，化合物3作用后，K562细胞早期凋亡和晚期凋亡比率都明显上升，细胞增殖的进程在G1期受到阻滞，体外增殖率降低。实验证明，一些化合物以及尚未进行分离纯化的部位具有很好的选择性肿瘤细胞毒活性，本实验对于植物资源抗肿瘤中药的研发具有一定的参考价值。但是中药成分复杂，其药效作用的发挥具有多靶点、多向调节的特点，异叶败酱化学成分抗肿瘤作用的确切机制仍需进一步研究。

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Study on the inhibitory effect of extracts from Patrinia heterophylla Bunge on leukemic cells in vitro

LIU Li1,2, MU Li-hua2, LIU Ping2
(1. Shanxi University of Chinese Traditional Medicine, Taiyuan 030024, China; 2. Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective: To study the inhibitory effect of extract from Patrinia heterophylla Bunge on the proliferation of leukemic cells in vitro. Methods: Isolated compounds were obtained from the whole plant Patrinia heterophylla Bunge through the means of chromatographic separation. The leukemic cells HL-60, K562 and Jurkat were cultured with different concentrations of extract from Patrinia extracts and compounds. CCK-8 assay was used to detect the inhibition of those extracts and compounds on human leukemic cell HL-60, K562 and Jurkat. And the effect of compound 3 on K562 cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. Results: Both extracts and monomeric compounds had a certain dosedependent inhibitory effect on the proliferation of leukemic cells. Different concentration of compound 3 could induce different degree of apoptosis of K562 cells. The early apoptosis rate was signif i cantly higher than that of the control group (P ＜ 0.01). The percentage of cells in G0/G1phase increased from 42.34% to 59.48% and 64.72%, which was signif i cantly different from that of the control group (P ＜ 0.01). Conclusion: The Patrinia heterophylla Bunge has obvious inhibitory effect on the proliferation of leukemic cells in vitro. Compound 3 can induce the apoptosis of K562 cells and block the cell cycle in G0/G1phase. The basis of antitumor pharmacological effects is likely to be related to the iridoid components.

Patrinia heterophylla Bunge; Leukaemia; Cell apoptosis; Iridoid

R96

A

1672 – 8157(2017)03 – 0150 – 04

2017-01-15

2017-03-17）

国家自然科学基金资助项目（31000153）

刘屏，女，研究员，研究方向：中药化学与中药药理。E-mail：liuping301@126.com

刘俐，女，在读硕士研究生，研究方向：中药活性成分筛选。E-mail：zliuli0227@126.com