大鼠学习记忆能力及其海马内TNF-α、IL-6含量的增龄性改变

金 海，陈 晨，张明辉，吴 芹，石京山，金 凤

(1.遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 贵州省消化病研究所，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；4.遵义医学院 药学院,贵州 遵义 563099)



基础医学研究

大鼠学习记忆能力及其海马内TNF-α、IL-6含量的增龄性改变

金 海1,2，陈 晨4，张明辉4，吴 芹3，石京山3，金 凤3

(1.遵义医学院附属医院 消化内科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 贵州省消化病研究所，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；4.遵义医学院 药学院,贵州 遵义 563099)

目的 探讨大鼠学习记忆能力及其海马内神经炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的增龄性改变。方法 SD大鼠42只，雌雄各半，分别为2月龄15只，6月龄13只，12月龄14只，Morris水迷宫检测不同月龄大鼠空间学习记忆能力，real time RT-PCR法检测大鼠海马TNF-α和IL-6 mRNA的表达，ELISA检测大鼠海马TNF-α和IL-6蛋白的含量。结果 定位航行实验中，6月龄大鼠的平均逃避潜伏期最短，相比于12月龄，平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，相比于2月龄，平均逃避潜伏期变化不明显(P>0.05)，12月龄大鼠的学习成绩与2月龄比较无统计学意义(P>0.05)；空间探索实验中，6月龄大鼠进入平台区次数最多、原平台象限滞留时间百分比及运动距离百分比最高，6月龄大鼠在原平台象限运动距离百分比较2月龄显著增加(P<0.05)，而原平台象限滞留时间百分比及运动距离百分比变化不明显(P>0.05)，6月龄大鼠进入平台区次数、原平台象限滞留时间百分比及原平台象限运动距离百分比与12月龄大鼠比较均显著增加(P<0.05)，12月龄大鼠的学习成绩与2月龄大鼠比较差异无显著性(P>0.05)。real time RT-PCR结果表明，与2月龄及12月龄比较，6月龄大鼠海马TNF-α、IL-6 mRNA表达明显增高(P<0.01)；ELISA结果显示，相比于2月龄及12月龄，6月龄大鼠海马TNF-α、IL-6蛋白含量均显著增高(P<0.01)。12月龄大鼠海马TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白含量与2月龄比较无统计学意义(P>0.05)。结论 大鼠学习记忆能力的增龄性改变与海马TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白水平的增龄性改变呈对应关系。

学习记忆；大鼠；增龄；炎症；肿瘤坏死因子α；白细胞介素6

大脑在生长、发育及衰老过程中，学习记忆能力也相应变化，这种变化的机制研究是目前神经科学研究的热点之一。神经炎症不但参与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等中枢神经系统退行性疾病的发生发展过程[1-2]，而且在衰老过程中也扮演极其重要的角色[3]。研究发现，炎症因子TNF-α和IL-6的水平与健康老年人群的发病率和死亡率密切相关[4]，然而，神经炎症和学习记忆与年龄依赖性的相关性研究尚未见报道，故本研究采用2月龄、6月龄和12月龄大鼠初步分析学习记忆能力和神经炎症与年龄依赖性的相关性，为阐明增龄性学习记忆障碍的脑内机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，雌雄各半，2月龄15只(250±20)g、6月龄13只(400±20)g及12月龄14只(550±20)g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，清洁级，许可证号：SCXK(渝)20070005。

1.2 主要仪器与试剂 WMT-100 Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)，Icycler IQ实时荧光定量PCR仪、iMark 酶标仪(美国BIO-RAD公司)，MILLI-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司)，Eppendorf 5417R冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，NANODROP 2000分光光度计(美国Thermo公司)。ELISA检测试剂盒(北京北方生物技术研究所)，引物、RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)。

1.3 Morris水迷宫检测 在进行水迷宫训练前1日将不同月龄大鼠置于未放安全岛的水池中自由游泳2 min，使其适应环境。检测中将大鼠放于置有安全岛的水池中游泳，并由WMT-100图像处理系统自动记录大鼠的游泳轨迹及时间。Morris水迷宫检测分为2步：第1步为定位航行实验，第1～4日，每日训练2次(上、下午各1次)，安全岛放在同一位置，从东、西、南、北4个不同入水点，将大鼠面朝池壁放入水池中，检测大鼠逃避潜伏期，取每日2次的平均成绩来评价大鼠的学习记忆能力。第2步为空间探索实验，于实验第5日，移去安全岛，将大鼠从同一入水点放入水中，记录2 min内大鼠进入平台区次数、原平台象限滞留时间百分比及原平台象限运动距离百分比，检验大鼠凭记忆找到原安全岛的能力。

1.4 ELISA检测大鼠海马TNF-α和IL-6的水平 水迷宫检测结束后，每组大鼠各取6～8只，经10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后断头取出脑组织，在冰盒上快速分离右侧海马于EP管中，按照1∶5比例加入预冷0.01 mmol/L PBS(pH 7.2～7.4)，匀浆后离心(1 000×g，20 min，4 ℃)，取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，分装后-80 ℃保存备用。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α和IL-6的含量，按照试剂盒操作说明进行。

1.5 real time RT-PCR检测大鼠海马TNF-α和IL-6 mRNA的表达 待水迷宫检测结束，每组大鼠各取4只，经10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后断头取出脑组织，在冰盒上快速分离右侧海马于去酶EP管中，加入Trizol 0.5 mL，按照TaKaRa生物工程公司的RNA提取试剂盒提取RNA。按TaKaRa生物工程公司的逆转录试剂盒操作说明配制逆转录反应体系，逆转录条件：37 ℃×15 min，85 ℃×5 s，逆转录的cDNA于4 ℃保存备用。PCR 反应体系：SYBR superMix 7.5 μL，引物混合液(上游和下游)0.5 μL，DEPC水4 μL，稀释2倍的cDNA 3 μL，总体积15 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火1 min，共40个循环。dCt=Ct average-中间值，基因的表达量=2^(-dCt)，目的基因的相对表达量=目的基因表达量/内参基因表达量。TNF-α的上游引物：5′-TGAGCACAGAAAGCATGATC-3′，TNF-α的下游引物5′-TACAGGCTTGTCAC TCGAATT-3′；IL-6的上游引物：5′-TGTATGAACAGCGATGATG-3′，IL-6的下游引物：5′-AGAAGACCAGAGCAGATT-3′；β-actin的上游引物：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，β-actin的下游引物：5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′。

2 结果

2.1 不同月龄大鼠逃避潜伏期的比较 在定位航行实验中，6月龄大鼠学习成绩最好，即平均逃避潜伏期最短，至定位航行第3、4日，与12月龄大鼠比较，平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，与2月龄大鼠比较差异无统计学意义(P>0.05，见图1)。

与6月龄组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 不同月龄大鼠逃避潜伏期的比较

2.2 不同月龄大鼠空间搜索实验的比较 由表1可见，6月龄大鼠空间搜索成绩最好，与2月龄组比较，6月龄大鼠在原平台象限运动距离百分比明显增加(P<0.05)，而通过平台区的次数及原平台象限滞留时间百分比均无统计学意义(P>0.05)，与12月龄组比较，6月龄大鼠通过平台的次数、原平台象限滞留时间百分比及运动距离百分比均显著增加(P<0.05)，而2月龄与12月龄大鼠通过平台区的次数、原平台象限滞留时间百分比及运动距离百分比均无明显差异(P>0.05)。

表1 不同月龄大鼠空间探索实验的比较

组别(月龄)进入平台次数(次)原平台象限滞留时间百分比(%)原平台象限运动距离百分比(%)229.11±6.0135.51±5.2833.84±4.65*633.78±5.8941.17±8.1339.10±4.58 1225.56±4.10**32.82±6.17*32.70±6.05*

与6月龄组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 不同月龄大鼠海马中TNF-α、IL-6蛋白含量的比较 6月龄大鼠海马TNF-α、IL-6蛋白含量最高，与2月龄和12月龄组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，而12月龄与2月龄组比较无统计学意义(P>0.05，见图2A)。

2.4 不同月龄大鼠海马中TNF-α、IL-6 mRNA表达的比较 由图2B所见，6月龄大鼠TNF-α、IL-6 mRNA的表达与2月龄和12月龄组比较，差异均具有统计学意义(P<0.01)，而12月龄与2月龄大鼠比较差异不明显(P>0.05)。

与6月龄组比较，**P<0.01。 图2 不同月龄大鼠海马TNF-α、IL-6含量(A)和mRNA表达(B)的比较

3 讨论

学习、记忆功能是大脑的高级神经活动，动物与人类一样进入中年期以后，学习记忆能力随年龄增长而逐渐减退[5]。近年研究发现，免疫系统不仅是机体对内外环境的适应和反应体系，而且与细胞分化、发育等过程密切相关，并从根本上参与了机体老化的全过程[6]。研究表明，脑内免疫炎症反应在衰老过程中扮演重要角色，老化与细胞因子及炎症标记物增加有关，年龄相关的免疫系统变化即免疫衰老导致细胞因子分泌增加，这是慢性炎症的主要原因，这种现象被称为“炎性衰老”[7-8]。高水平的细胞因子TNF-α和IL-6与老年人发病率和死亡率的增加相关联。在健康的老年群体中，高水平的TNF-α和IL-6可预测死亡率，对于体弱、年长者，TNF-α和IL-6也可作为疾病标志物。循环中TNF-α的含量最能预测体弱、年长者的死亡率，而IL-6的含量是健康、年长者死亡率的最危险标记[4-9]。然而有关神经炎症的增龄性改变和学习记忆之间的联系尚未见报道，故本研究采用2月龄、6月龄和12月龄大鼠来分析神经炎症和年龄依赖性以及学习记忆能力的相关性。

研究结果表明，大鼠的学习记忆能力从2月龄至6月龄逐渐增强，6月龄学习记忆能力最强，而2月龄与12月龄相似，说明大鼠的学习、记忆能力在6月龄即青年期最强，与王蓉等[5]报道相似。此外，从2月龄到6月龄组大鼠海马TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白含量亦逐渐升高，以6月龄升高最明显，尤其IL-6的增高较2和12月龄大鼠更为显著，2月与12月龄大鼠之间无明显差异，该结果提示正常衰老大鼠的神经炎症在6月龄前随年龄增长呈逐渐增强趋势，6月龄时神经炎症反应最强，之后逐渐减弱；12月龄与2月龄相当，提示神经炎症与衰老过程中学习记忆能力变化之间的联系对年轻患者比年老患者有更紧密的相关性。本研究结果显示，大鼠学习记忆的增龄性改变与海马TNF-α、IL-6含量呈对应关系，即大鼠学习记忆能力在6月龄即青年期最强，而大鼠海马内炎症因子TNF-α、IL-6的含量在6月龄也最高，两者的变化趋势相同，因此推测这种变化的原因在于大鼠中枢神经系统发育在不同发育时期存在差异，6月龄大鼠即青年期是机体发育的最旺盛时期，此期大脑神经系统发育最完善，神经突触发育最好[5]，神经丝蛋白含量最高，神经网络结构最完整[10]，说明神经元之间的联系密切，信息传递功能最强，故青年期学习记忆能力最强。此外，由于衰老涉及机体的多个系统和器官，是一个多因素参与的复杂过程，其中免疫系统在体内发挥着防御、监视等作用，免疫功能的减弱必将引起体内其他系统的功能失调，使机体易受到各种有害因素的侵袭，从而导致疾病[11-12]。青年期机体的免疫系统发育最完善，免疫反应能力最强，机体合成和分泌细胞因子的能力亦最强，故TNF-α、IL-6的含量最高。众所周知，AD是一种年龄相关的中枢神经系统退行性疾病，随着年龄的增加，AD发病率呈上升趋势，并且神经炎症参与AD的发生发展过程[13-14]。荷兰科学家利用一批年龄为52～97岁已确诊为AD患者的研究发现，小于80岁的AD患者中颞叶皮质的小神经胶质细胞和星形细胞显著多于年龄更大的AD患者，提示神经炎症与AD发病机制之间的联系对年轻患者比年老患者有更紧密的相关性[15]，与本研究结果相似。

综合本研究结果及文献报道，可以推测，在临床上年轻的AD患者比年长的AD患者更适宜进行抗炎治疗，这为不同年龄AD患者的临床抗炎治疗提供导向，而具体的疗效及更多可能的机制有待更深入研究。

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[收稿2017-03-27;修回2017-05-15]

(编辑：王静)

The changes of learning and memory ability as well as hippocampal TNF-α and IL-6 levels in different age rats

JinHai1,2,ChenChen4,ZhangMinghui4,WuQin3,ShiJingshan3,JinFeng3

(1.Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Institute of Digestive Diseases of Guizhou Province,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;3.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;4.College of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To explore the changes of learning and memory ability and hippocampal tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-6(IL-6)levels in different age rats.Methods 42 Sprague Dawley rats(male and female each half)were used：2 months(n=15),6 months(n=13),and 12 months(n=14).Learning and memory ability in different age rats were observed by Morris water maze,the levels of TNF-α,IL-6 mRNA and protein in the hippocampus were determined by real time RT-PCR and Western blot respectively.Results In the navigation experiment,the average escape latency in 6-month old rats was shortest,compared to 2-month rats,the change of average escape latency is not obvious (P>0.05),compared to 12-month rats,the average escape latency was significantly shortened (P<0.05),and there was no statistical significance between 12-month and 2-month rats (P>0.05).In the space exploration experiment,6-month-old rats had longer times of passing platform,percent of residence and swim distance on original platform quadrant,compared with 2-month-old rats,the percent of swim distance on original platform quadrant in 6-month-old rats was significantly increased(P<0.05),while there were no significant changes in the times of passing platform and percentage of residence time on original platform quadrant in 6-month-old rats(P>0.05).Compared with 12-month-old rats,the time of passing platform,percent of residence time and swim distance on original platform quadrant in 6-month-old rats were increased obviously(P<0.05),and there is no significant difference in 12-month-old rats compared with 2-month-old rats(P>0.05).The results of real time RT-PCR showed that TNF-α and IL-6 mRNA were significantly increased in hippocampus of 6-month-old rats compared with 2 and 12 month-old-month rats(P<0.01).The results of ELISA showed that TNF-α and IL-6 protein levels were significantly increased in the hippocampus of 6-month-old rats compared with 2- and 12-month-old rats(P<0.01).There was no significant change in hippocampal TNF-α IL-6 mRNA and protein levels in 12-month-old rats compared with 2-month-old rats(P>0.05).Conclusion The changes of learning and memory ability in different age rats showed a corresponding relationship with hippocampal TNF-α,IL-6 mRNA and protein levels.

learning and memory;rat;age-increasing;inflammation;tumor necrosis factor-alpha (TNF-α);interleukin-6 (IL-6)

国家自然科学基金资助项目(NO：81360311，81660599,81160400)；遵义医学院基金资助项目(NO：2013F-686，F-738)；贵州省中医药管理局项目(NO：QZYY2010-59,D274)。

金凤，女，博士，教授，研究方向：神经药理及肿瘤药理,E-mail:jinfeng1115@zmc.edu.cn。

R322.81

A

1000-2715(2017)03-0238-05