Caco-2细胞模型研究淫羊藿苷的吸收转运

周 林，邱 敏，徐亚沙，鲁艳柳，陆远富

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)



基础医学研究

Caco-2细胞模型研究淫羊藿苷的吸收转运

周 林，邱 敏，徐亚沙，鲁艳柳，陆远富

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

目的 采用Caco-2细胞模型，研究淫羊藿苷(ICA)吸收转运特性。方法 成功制备Caco-2细胞模型后，分为空白组、ICA组、氢离子组、无钠离子组、ATP抑制剂组，给予ICA(10 μmol/L)3 h后，采用UPLC-MS分析，比较刷状缘侧、基底侧及细胞样本中ICA及淫羊藿次苷II(ICS II)的含量，观察不同条件对ICA、ICS II吸收的影响。结果 与ICA组相比，氢离子组、无钠离子组及ATP抑制剂组刷状缘侧ICA含量显著降低(P<0.05)，基底侧ICA含量显著升高(P<0.05)，而细胞中仅无钠离子组ICA含量显著增高(P<0.05)；与ICA组相比，无钠离子组刷状缘侧、基底侧、细胞中ICS II含量均无显著变化，氢离子组基底侧、细胞中ICS II含量显著升高(P<0.05)，ATP抑制剂组刷状缘侧、基底侧ICS II含量显著增高(P<0.05)。结论 氢离子、钠离子以及ATP对ICA及ICS II的吸收转运有显著影响。

淫羊藿苷；淫羊藿次苷 II；Caco-2细胞模型；氢离子；钠离子；ATP

中药淫羊藿是小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)等的干燥地上部分，最早记录在《神农本草经》中，具有“补肾壮阳，祛风除湿”之效，临床常用于治疗阳痿、腰膝酸软、风湿痹痛等症。黄酮醇苷类化合物淫羊藿苷(icariin，ICA)是淫羊藿的主要活性成分之一[1]，具有抗肿瘤、调节内分泌、调节免疫，改善心脑血管功能等多种药理作用[2-8]，但是其口服生物利用度低(12%)[9]，研究其吸收转运机制，有利于淫羊藿的进一步开发和利用。研究表明，ICA在肠道刷状缘侧可被代谢酶代谢成淫羊藿次苷Ⅱ(icarisideⅡ，ICS II)[8]，ICS II亦可作为有效成分发挥药效[10]。因此，在研究ICA吸收转运时，ICS II的吸收转运情况也应受到重视。Caco-2单层细胞模型的结构和功能类似完全分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并且含有与小肠刷状缘上皮细胞相关的酶系，能很好地模拟药物在肠道的吸收[11-12]。因此，本研究采用Caco-2细胞模型，通过改变给药侧的氢离子浓度、钠离子浓度和抑制细胞内ATP的生成来考察ICA的吸收转运特性，为提高ICA口服生物利用度提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 淫羊藿苷标准品，中国药品生物制品检定所，批号：110737-200415；淫羊藿次苷标准品，中国食品药品检定研究院，批号：X45Q-NY8F；大豆苷元，南京标科生物科技有限公司；淫羊藿苷，南京标科生物科技有限公司，批号：111852-201102；色谱纯乙腈、甲醇，美国Dikmapure公司；Caco-2细胞，中国昆明细胞库提供；DMEM培养基，美国HyClone公司；胎牛血清，美国Gibco有限公司；青霉素/链霉素，中国索莱宝科技有限公司；D-hanks缓冲液，中国索莱宝科技有限公司。

Q-Exactive四极杆-轨道阱质谱色谱联用仪，美国Thermo科技有限公司；Millicell-ERS细胞电阻仪，北京明阳科华生物科技有限公司；24孔transwell细胞培养板，康宁生命科学产品有限公司；细胞计数仪，艾力特国际贸易有限公司；CO2培养箱，美国Thermo科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Caco-2细胞模型的制备 将Caco-2细胞浓度调整到8×104个/cm2，接种于24孔Transwell小室，置37 ℃培养箱中，21 d左右分化形成。当电阻值大于500 Ω·cm2、表观渗透率低于1×10-6cm/s时，表明细胞单层具有紧密性和完整性，可作为小肠吸收实验的体外模型[9-10]。实验前，弃去培养液，分别向刷状缘侧(apical side，AP)和基底侧(basolateral side，BL)加入37 ℃的D-hanks缓冲液漂洗细胞3次，最后一次置于37 ℃恒温水浴箱中孵育30 min后，弃去缓冲液，以保细胞表面无干扰物质。

1.2.2 ICA及ICS II吸收转运实验 考察pH的影响：将实验组分为空白组、ICA组和氢离子组(pH 5.5)。在刷状缘侧，氢离子组给予ICA浓度为10 μmol/L的Mes-D-hanks液(pH 5.5)100 μL，ICA组给予含相同浓度ICA的Hanks-Hepes液100 μL；在基底侧，均换上600 μL Hanks-Hepes液。37 ℃孵育3 h后，分别收集刷状缘侧、基底侧缓冲液及细胞样本，供检测。

考察钠离子影响：将实验组分为空白组、ICA组和无钠离子组。在刷状缘侧，ICA组给予100 μL ICA浓度为10 μmol/L的含钠离子试液(10 mmol/L HEPES、130 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4、5 mmol/L葡萄糖、1 mmol/L CaCl2)，无钠离子组给予100 μL ICA浓度为10 μmol/L的无钠离子试液(10 mmol/L HEPES、130 mmol/L (CH3)3N(Cl)CH2CH2OH、10 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4、5 mmol/L葡萄糖、1 mmol/L CaCl2)；在基底侧，均加入600 μL含钠离子试液。37 ℃孵育3 h后，分别收集刷状缘侧、基底侧缓冲液及细胞样本，供检测。

考察ATP影响，将实验组分为空白组、ICA组和ATP抑制剂组。ATP抑制剂组在刷状缘侧，先加入90 μL ATP抑制剂(5 mmol/L叠氮化钠、50 mmol/L脱氧葡萄糖)，孵育10 min，再加入10 μL含100 μmol/L ICA的D-hanks液；ICA组在刷状缘侧，先加入90 μL D-hanks液孵育10 min，再加入10 μL含100 μmol/L ICA的D-hanks液；在基底侧，均加入600 μL D-hanks液。37 ℃孵育3 h后，分别收集刷状缘侧、基底侧缓冲液及细胞样本，供检测。

1.2.3 检测ICA及ICS II的色谱条件及质谱条件 色谱条件：采用Hypersil GOLD C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.9 μm)分离，流动相组成为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱(V/V，0～1 min 5%～50% A，1～6 min 50%～95% A，6～8 min 95% A)，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量为5 μL。质谱条件：ESI离子源，m/z检测范围100～1 500，鞘气和辅助气流速分别为50、13 arb，雾化温度425 ℃，毛细管温度350 ℃，负离子全扫描检测模式。

1.2.4 对照品溶液的配制 精确称取ICA、ICS II标准品1.0 mg，分别置于1 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成1.5 mmol/L的ICA和2.0 mmol/L的ICS II标准品储备液，待用。

精确称取大豆苷元标准品1.0 mg，置于1 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成浓度为4.0 mmol/L的大豆苷元内标化合物标准品储备液，待用。

1.2.5 样本处理 用120 μL 0.01% Triton静置处理加药后的细胞样本(约5×107个/孔)15 min，取出全部样液超声(功率：320 W)30 min，混匀后取100 μL加入5 μL内标溶液，300 μL甲醇，涡旋，15 000g离心10 min，取上清供UPLC-MS检测。

吸取100 μL AP侧、BL侧缓冲液，分别加入5 μL内标溶液，300 μL甲醇，涡旋，15 000 g离心10 min，取上清供UPLC-MS检测。

2 结果

2.1 ICA、ICS II检测方法的建立 采用UPLC-MS建立样品分析方法，如图1所示，在0.062 5～4.0 μmol/L浓度范围内，ICA及ICS II线性方程分别为：Y=2 441 774.22X+80 703.68(r=0.999 8)；Y=691 465 897.28X+90 521 629.50(r=0.999 5)，24 h内样品均稳定，其RSD分别为6.1%和5.7%，重现性良好，RSD分别为5.9%和3.2%，平均加样回收率分别为96.6%和102.1%，RSD分别为9.1%和3.6%，ICA日间、日内精密度RSD分别为5.6%和6.1%，ICS II日间、日内精密度RSD分别为5.8%和3.9%，即本方法可快速、灵敏、准确的检测ICA及ICS II的浓度。

A：空白组；B：标准品溶液；C：ICA组；1：ICA，2：大豆苷元，3：ICS II。图1 ICA及ICS II的选择离子图

2.2 pH对ICA、ICS II吸收转运的影响 如图2所示，与ICA组相比，AP侧氢离子组ICA的浓度明显降低(P<0.05)，BL侧ICA含量明显升高(P<0.05)，而在细胞中变化不明显(P>0.05)；在细胞中，氢离子组ICS II浓度较ICA组高1.82倍，在BL侧，较ICA组高4.8倍。

Control：ICA组，正常条件下给药；H+(pH5.5)：氢离子组，在pH=5.5条件下给药。n=4；*：与ICA组相比，P<0.05。图2 pH对ICA和ICS II吸收转运的影响

2.3 钠离子对ICA、ICS II吸收转运的影响 如图3所示，与ICA组相比，无钠离子组AP侧ICS的浓度明显降低(P<0.05)，而在BL侧和细胞中，ICA含量明显升高(P<0.05)；钠离子浓度变化对ICS II吸收无明显影响(P>0.05)。

Control：ICA组，正常条件下给药；None Na+：无钠离子组，无钠离子条件下给药。n=4，*：与ICA组相比，P<0.05。图3 钠离子对ICA和ICS II吸收转运的影响

2.4 ATP 对ICA、ICS II吸收转运的影响 如图4所示，在AP侧，ATP抑制剂组ICA含量较ICA组低(P<0.05)，而ICS II含量较ICA组高(P<0.05)；在BL侧，ATP抑制剂组ICA、ICS II含量明显高于ICA组(P<0.05)，在细胞中两组无明显差异(P>0.05)。

Control：ICA组，正常条件下给药；ATP inhibitor：ATP抑制剂组，ATP缺乏的条件下给药。n=4，*：与ICA组相比，P<0.05。图4 ATP对ICA及ICS II吸收转运的影响

3 讨论

小肠是口服药物吸收的主要部位，分布在肠道的转运蛋白包括ATP结合盒式膜转运体家族和溶质转运体超家族[13]。ATP结合盒式膜转运体家族，须利用ATP的能量来实现对相关药物的转运[13-14]，而溶质转运超家族需借助氢、钠及钙等离子在胞内、外形成电位差，才能完成对相关药物的转运[15-16]。ICA、ICS II在肠道的吸收需要转运蛋白的参与[9,14]。因此，细胞外环境pH、钠离子浓度以及细胞中产生的ATP会对ICA、ICS II的吸收转运起到重要影响。

本实验结果发现，通过增加刷状缘侧氢离子的浓度，基底侧ICA、ICS II含量显著升高(P<0.05)，提示氢离子依赖型转运蛋白可能参与了ICA及ICS II的吸收转运，肠道pH偏碱性不利于ICA、ICS II的吸收，可能是ICA口服生物利用度低的一个原因；减少刷状缘侧钠离子的浓度，基底侧ICA含量显著升高(P<0.05)，而对ICS II的含量无明显影响，提示钠离子依赖型转运蛋白可能参与了ICA的外排转运；通过抑制细胞内ATP的生成，基底侧ICA含量显著升高(P<0.05)，同时刷状缘侧和基底侧的ICS II含量显著增高(P<0.05)，提示ICA的主动转运吸收过程中外排转运可能占主要地位，这也可能是其口服生物利用度低的另一个原因。

通过Caco-2细胞模型，发现氢离子、钠离子以及细胞内产生的ATP对ICA及ICS II的吸收转运有显著影响，为进一步研究改善ICA口服生物利用度提供理论依据。

[1] 韩惠,单淇,周福军,等.淫羊藿中活性成分的代谢产物研究进展[J].现代药物与临床,2013,28(1):78-81.

[2] 甑瑾,王梅玲,朱润秀,等.淫羊藿苷对阿尔兹海默病大鼠模型COX-2表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2016,14(22):2629-2630.

[3] Xu S F,Jin T,Lu Y F,et al.Effect of icariin on UDP-glucuronosyltransferases in mouse liver [J].Planta Med,2014,80(5):387-392.

[4] Chen M,Hao J,Yang Q,et al.Effects of icariin on reproductive functions in male rats[J].Molecules,2014,19(7):9502-9514.

[5] Li B,Duan X,Xu C,et al.Icariin attenuates glucocorticoid in sensitivity mediated by repeated psychosocial stress on an ovalbumin-induced murine model of asthma[J].Int Immunopharmacol,2014,19(2):381-390.

[6] Zhou H,Yuan Y,Liu Y,et al.Icariin attenuates angiotensin II-induced hypertrophy and apoptosis in H9c2 cardiomyocytes by inhibiting reactive oxygen species-dependent J N K and p38 pathways[J].Exp Ther Med,2014,7(5):1116-1122.

[7] 蔡锐,李菲,董红心,等.淫羊藿苷对Tg2576小鼠学习记忆功能及海马神经细胞再生的影响[J].遵义医学院学报,2015,38(4):350-354.

[8] 李利生,刘娟,罗云梅,等.淫羊藿苷对野百合碱诱导的肺动脉高压模型大鼠血流动力学的影响[J].遵义医学院学报,2016,39(3):229-232.

[9] 刘晓燕.淫羊藿苷体内处置及代谢动力学研究[D].山东大学,2009:52-54.

[10] 吴彩胜.淫羊藿有效成分分析及其体内代谢的研究[D].北京协和医学院,2011:25-26.

[11] 帕丽达.阿布力孜,丛媛媛,米仁沙,等.Caco-2细胞体外吸收模型的建立及评估[J].亚太传统医药,2011,4(7):6-8.

[12] 高坤,孙进,何仲贵.Caco-2细胞模型在口服药物吸收研究中的应用[J].沈阳药科大学学报,2005,22(6):469-474.

[13] 刘银丽,乐健,洪战英.肠道转运蛋白与中药有效成分的吸收[J].药学服务与研究,2014,14(2):85-88.

[14] 孟华,王广基,孙建国,等.体外及在体方法研究淫羊藿苷吸收特性和机制[J].中国药理通讯,2004,21(3):45.

[15] Xu B.Wheat grain yield on saline soils is improved by an ancestral Na+transporter gene[J].Nature Biotechnology,2012,30(4):360.

[16] Zhao K,Yang S Y,Zhou S H,et al.Fluorodeoxyglucose uptake in laryngeal carcinoma is associated with the expression of glucose transporter-1 and hypoxia-inducible-factor-1α and the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B pathway[J].Oncology Letters,2014,7(4):984-990.

[收稿2017-02-09;修回2017-05-14]

(编辑：王静)

Absorption and transportation of icariin across Caco-2 cell model

ZhouLin,QiuMin,XuYasha,LuYanliu,LuYuanfu

(Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education and The Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To study the absorption and transportation of icariin (ICA) using Caco-2 cell model.Methods The experiments included the control group,the ICA group,the hydrogen ions group,the sodium ion free group and the ATP inhibitor group.ICA(10 μmol/l)was administrated for 3 h.The concentrations of ICA and icariside II(ICS II)in the apical side(AP),the basolateral side(BL)and the cell were measured by UPLC/MS.The effects of hydrogen ion,sodium ion,and ATP on the absorption and transportation were observed.Results Compared with ICA group,the contents of ICA were reduced in AP and increased in BL of the hydrogen ions group,the sodium ion free group,and the ATP inhibitor group(P<0.05),and only increased in cells of the sodium ion free group (P<0.05).And there were no significant differences on the contents of ICS II in AP,BL,and cells of the sodium ion free group.For the hydrogen ions group,the contents of ICS II were increased in BL and cells (P<0.05).For the ATP inhibitor group,the contents of ICS II were increased in AP and BL(P<0.05).Conclusion Hydrogen ion,sodium ion and ATP significantly affect the absorption and transportation of ICA and ICS II.

icariin;icariside II;Caco-2 cell model;hydrogen ion;sodium ion;ATP

国家自然科学基金资助项目(NO：81460632)。

鲁艳柳，女，博士，副教授，研究方向：药物代谢动力学与毒理学研究，E-mail:lyl206979@sina.com；陆远富，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：药物代谢动力学与毒理学，E-mail: yflu@zmc.edu.cn。

R969

A

1000-2715(2017)03-0234-04