小桐子雌雄花性别分化过程中潜在控制基因挖掘

周景龙

摘要：指出了小桐子雌雄比例失调，极大地降低了小桐子的产量。从小桐子花入手，通过分子手段来增加雌花比例，进而提高小桐子产量。通过SSH和RNA-seq相结合的方法，共找到候选基因基因3个。并利用premer premier5.0对3个基因设计引物，以EF1α为内参，进行qRT-PCR。结果表明： JCGZ_23177在雌花中高效表达， JCGZ_06508和 JCGZ_17929在雄花中高效表达，通过NCBI 数据库分析，3个基因分别为S-腺苷甲硫氨酸合酶1（S-adenosylmethionine synthase 1）、肽甲硫氨酸亚砜还原酶A5（peptide methionine sulfoxide reductase A5）、脂氧合酶6（lipoxygenase 6）。

关键词：小桐子；抑制性消减杂交技术；转录组测序；实时定量逆转录聚合酶链反应

中图分类号：Q949.753.5

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）10021805

1 引言

小桐子（Jatropha curcas L.），又名麻疯树、木生花[1]等，从小桐子种子中提取的生物柴油具有很多优点，主要体现在安全性高、可再生、爆发力强、硫化物排放低、易于运输、污染少等方面，因此，小桐子也被认为是目前最有潜力的能源树种 [2，3]。小桐子雌花少雄花多[4]，若能阐明雌雄花分化机制便能提高雌花数量，提高小桐子产量。

2 材料和方法

2.1 实验材料

实验材料为小桐子雌花、雄花、花芽，取自云南省昭通市巧家县。实验室通过SSH（抑制消减杂交）技术已成功构建了小桐子雌花和雄花、雌花和花芽、雄花和花芽正反抑制消减文库6个，得到SSH重组菌约200个左右。

2.2 实验方法

（1）通过重组菌活化—培养—PCR扩增—电泳—测序—去接头序列—NCBI 同源性分析。

（2）利用NGS（高通量测序技术）对小桐子转录组进行测序，以|log2（FoldChange）|>1 且 qvalue<0.005为阈值，筛选雌雄花差异表达基因。

（3）利用SSH和RNA-seq技术相结合的方法，筛选候选基因。

（4）利用qRT-PCR（荧光定量PCR）技术对候选基因进行相对定量分析。

3 结果与分析

3.1 SHH差异表达基因筛选

通过NCBI Blast分析可发现小桐子生长素反应因子5、小桐子MADS-box蛋白AGL9、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、小桐子蔗糖合成酶、14-3-3配体蛋白、蛋白质生长素信号转导F-box 2、小桐子光敏色素A等多个小桐子已知同源基因，整体数据列表见表1。

3.2 RNA-seq原始数据分析

RNA-seq得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对raw reads（原始数据）进行过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。从图1可以看出，小桐子雌花、雄花、花芽的clean reads分别占原始数据的97.37%、97.50%和97.46%；含 N（N表示无法确定碱基信息）的reads分别占原始数据的0.01%、0.01%和0.01%；低质量的reads分别占原始数据的2.25%、2.18%和2.19%；带接头的reads分别占原始数据的0.38%、0.31%和0.35%。以上数据表明，测序数据质量好、错误率低，可进行后续实验。

3.3 RNA-seq差异表达基因筛选

对差异基因进行筛选，从差异倍数和显著水平两个方面进行评估，阈值设定一般为： |log2（FoldChange）|>1 且 qvalue<0.005。获得C vs X（雌花雄花相互比较）差异基因共有4352个，其中上调基因2365个，下调基因1987个；C vs Y（雌花花芽相互比较）差异基因1917个，其中上调基因900个，下调基因1017个；X vs Y（雄花花芽相互比较）差异基因5333个，其中上调基因2076个，下调基因3257个。

3.4 qPCR总RNA提取

小桐子花组织总RNA的提取采用OMEGA Bio-Tek公司的E.Z.N.ATM Plant RNA 试剂盒，结果如图2所示，条带清晰，28S与18S之比约为2∶1，还可以看到5S，说明RNA提取结果较好。

3.5 内参基因和目的基因引物序列

通过SSH和RNA-seq相结合的方法，共找到相同基因3个，以EF1α为内参，并利用引物设计软件Primer premier5.0进行引物设计，结果见表2。

3.6 qPCR曲线

三个目的基因GCGZ_23177、GCGZ_06508、和GCGZ_17929，每个基因3个复孔，3种模板，以EF1α为内参，内参基因和目的基因qPCR熔解曲线和扩增曲线见图3、4、5和6，未见非特异性和引物二聚体峰图，荧光定量效果较好。

4 结语

小桐子是目前公认的最有潜力的生物能源树种，其易于种植、管理，且可在条件恶劣的环境下生长，是国家强力推荐的脱贫致富的良好树种。生物柴油主要是从小桐子种子中提取，但小桐子雌雄比例失调，极大的降低了小桐子的产量。据笔者了解，小桐子雌雄比例一般为1∶10左右[5]，有时甚至可达到1∶15。本实验从小桐子花入手，通过分子手段来增加雌花比例，进而提高小桐子产量。

实验中通过SSH和RNA-seq相结合的方法，并进行qRT-PCR。结果表明：JCGZ_23177在雌花中高效表达， JCGZ_06508和 JCGZ_17929在雄花中高效表达。由此可知，基因JCGZ_23177、JCGZ_06508、和JCGZ_17929在小桐子雌雄花分化方面具有重要作用。通过NCBI 数据库分析，基因JCGZ_23177、JCGZ_06508、和JCGZ_17929分别为S-腺苷甲硫氨酸合酶1（S-adenosylmethionine synthase 1）、肽甲硫氨酸亚砜还原酶A5（peptide methionine sulfoxide reductase A5）、脂氧合酶6（lipoxygenase 6）。该实验通过分子生物学手段共找到小桐子雌雄花分化的关键基因3个：S-腺苷甲硫氨酸合酶1（S-adenosylmethionine synthase 1）、肽甲硫氨酸亚砜还原酶A5（peptide methionine sulfoxide reductase A5）、脂氧合酶6（lipoxygenase 6），为加快小桐子产业化步伐起到一定的推动作用。

参考文献：

[1]李法社. 小桐子生物柴油制备的试验研究[D]. 昆明：昆明理工大学， 2008.

[2]Koh M Y， Ghazi T I M. A review of biodiesel production from Jatropha curcas L. oil[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2011， 15（5）： 2240～2251.

[3]张庆丰. 小桐子花发育调控基因AGAMOUS和AGAMOUs-LIKE基因的克隆及功能分析[D]. 北京：中国科学院大学， 2013.

[4]张 露. 小桐子细胞分裂素合成代谢关键酶基因的克隆及其功能分析兼论柬埔寨龙血树的遗传多样性[D]. 北京：中国科学院大学， 2013.

[5]何 璐， 張 德， 段曰汤，等. 金沙江干热区麻疯树（Jatropha curcas L.）杂交育种技术的初步研究[J]. 西南农业学报， 2012， 25（4）：1422～1426.