响应面法优化苋红素提取工艺及其抗氧化性

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(宁波大学食品科学与工程系,浙江宁波 315211)



响应面法优化苋红素提取工艺及其抗氧化性

熊茜,王春幸,孙朦,王凯凯,宋佳敏,许凤*,王鸿飞

(宁波大学食品科学与工程系,浙江宁波 315211)

彩苋,苋红素,响应面优化法,抗氧化性

苋菜又名米苋、赤苋、彩苋、青香苋、雁来红等,系苋科苋属一年生植物苋的茎叶。苋菜按其颜色分为红苋、绿苋和彩苋三种,在我国南北各地均有栽培,是夏季的主要蔬菜之一[1]。随着人们消费观念的变化,在满足蔬菜产品数量的同时,开始追求产品的内在营养、保健食疗价值,要求无污染、食用安全、方便等[2]。苋菜营养丰富,是一种十分优良的菜、粮、药兼用作物。现代医学和营养学研究表明,苋菜含有矿物质元素锌、钙、钾、钠等;维生素C、维生素E和维生素K以及18种氨基酸等,其中包括人体必需的8种氨基酸[3-4]。

苋菜中所含的苋红素是一种易溶于水的含氮有机物[5],它不同于花青素,属于甜菜素类中甜菜红素亚型的生物色素[6]。苋红素色泽鲜艳,安全无毒,是天然的食用色素,具有预防心血管疾病和某些癌症、保护视力、抗氧化、抗衰老、抗溃疡、抗炎等生理和药理作用[7-8]。目前,合成色素苋菜红广泛用于食品、饮料、药品、化妆品、烟草、饲料、食品包装材料等的着色[9],以天然苋红素取代合成色素,因其更符合现代消费者的消费需求,并具有广阔的市场前景。刘德良[10]以2%盐酸作为提取溶剂提取红苋草中的苋红素,廖芙蓉[11]等以籽粒苋花穗为原料,采用超声波辅助提取法,以10%乙醇作为溶剂提取其色素。

生物体内自由基种类繁多,以活性氧为主。活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)会导致蛋白质损伤、酶失活、膜脂过氧化等,从而引起机体衰老,诱发肿瘤等恶性疾病。寻找适当的外源性抗氧化剂,清除体内的自由基,对保持自由基稳衡性动态,治疗疾病和保护人体健康很有益处。有研究表明,野苋菜具有潜在的抗氧化活性[12-15]。本文以市售蔬菜彩苋为原料,采用响应面法优化苋红素的提取工艺,并在前人研究的基础上,对其抗氧化性开展进一步的研究,为天然苋红素的充分利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

彩苋 购于宁波庄市菜市场,选取新鲜、无病虫害的叶片进行实验;乙醇、盐酸等 均为分析纯;甜菜苷红色素标准品(纯度 ≥ 99%)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、硫酸亚铁、1,1-二硝基苦基苯肼(DPPH)、邻菲罗啉、邻苯三酚 国药集团化学试剂有限公司。

754型紫外分光光度计 上海美谱达科技有限公司;GL-16G-Ⅱ型离心机 湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司;水浴锅、烘箱 上海精宏实验设备有限公司;PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 原料制备 将买来的彩苋去根,保留地上的部分,洗净,沥干表面水分后,50 ℃烘干,粉碎后过60目筛,保存于干燥避光处备用[16]。精确称取1.0 g干燥的苋菜粉于烧杯中,加入蒸馏水40 mL,置于30 ℃的水浴锅中浸提1 h后对其进行抽滤,得到的滤液即为苋红素提取液。

1.2.2 确定最大吸收波长 将提取出的苋红素滤液用蒸馏水定容至100 mL,倒入光径1 cm的比色皿中,用可见分光光度计在400～700 nm的波长下进行波长扫描,确定其最大吸收光谱[17]。

1.2.3 苋红素标准曲线的测定及得率的计算方法 称取甜菜苷红色素标准样品0.2000 g,用水溶解定容至1000 mL,摇匀得浓度为0.20 mg/mL的苋红素标准储备液,加水配制成浓度分别为0、4、8、12、16、20 μg/mL的溶液,于最大吸收波长处测定其吸光度值。以溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制甜菜苷红色素的标准曲线图[18]。苋红素标准曲线为Y=0.0103X-0.0011,R2=0.9996。

苋红素得率(%)=苋红素含量/苋菜粉的质量×100

式(1)

其中,苋红素含量根据苋红素标准曲线计算得到。

1.2.4 提取溶剂种类对苋红素提取效果的影响 在提取温度为40 ℃,提取时间为30 min,料液比为1∶30的条件下,分别采用水、无水乙醇、50%乙醇、pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、2%盐酸作为提取剂进行提取。考察不同溶剂对苋红素提取效果的影响,从而确定最合适的提取剂。

1.2.5 苋红素提取的单因素实验条件优化 实验选择料液比、提取时间、提取温度作为苋红素提取效果的主要影响因素,以苋红素得率为考察指标,进行单因素实验。

准确称取6份1 g干燥的苋菜粉,分别加入10、20、30、40、50、60 mL提取剂进行提取,在40 ℃水浴锅中放置30 min后抽滤,取一定量滤液高速(10000 r/min)冷冻离心10 min,得到的上清液用水稀释后于538 nm处测定吸光度值。

准确称取6份1 g苋菜粉,加入40 mL提取剂进行提取,在温度为40 ℃的水浴锅中分别放置10、30、50、70、90、110 min后,进行以上相同的处理,于538 nm处测定吸光度值。

准确称取6份1 g苋菜粉,加入40 mL提取剂进行提取,分别在温度为20、30、40、50、60、70 ℃的水浴锅中浸提50 min后,进行以上相同的处理,于538 nm处测定吸光度值。

1.2.6 响应面法优化苋红素提取工艺 根据单因素实验结果,以提取时间(A)、提取温度(B)、料液比(C)为实验因素,以苋红素得率作为响应值,进行Box-Benhnken实验设计,实验因素水平及编码见表1。

表1 Box-Benhnken响应面优化实验因素水平表Table 1 The factors and levels table of Box-Benhnken experiment

1.2.7 苋红素抗氧化性的研究

1.2.7.1 苋红素总抗氧化能力的测定 本实验参照[19-20]的方法,采用FRAP法对苋红素的总抗氧化能力进行测定。

还原力标准曲线的绘制:分别取 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的FeSO4溶液3 mL,加入3 mL FRAP工作液,混匀后于37 ℃反应10 min,于593 nm处测定吸光度值。以FeSO4溶液的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

样品总抗氧化能力的测定:在最优条件下提取出苋红素溶液,并将其稀释成浓度分别为0.07、0.08、0.09、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/g的待测液,同时配制相同浓度VC溶液作为对照,按照绘制标准曲线的方法测定吸光度值,抗氧化化活性以相同吸光度值的FeSO4溶液来表示。

1.2.7.2 苋红素清除DPPH自由基能力的测定 苋红素清除DPPH自由基能力的测定方法参照董迪迪等[21]的方法有所改动。将提取出的苋红素稀释成浓度分别为0.10、0.14、0.18、0.27、0.34、0.45、0.55、0.68 mg/g的溶液(同时配制相同浓度的VC溶液)。向试管中加入样品液1 mL及0.02 mmol/L DPPH溶液2 mL,混合均匀后于暗处静置30 min,乙醇做参比,在517 nm处测定吸光度值A2;同样的操作,用等体积的蒸馏水代替样品液,测定吸光度值A0;不加DPPH,用等体积乙醇代替,分别加入1 mL不同浓度的样品液,同法操作测定吸光度值A1,按以下公式计算清除率:

式(2)

1.2.7.3 苋红素清除羟基自由基能力的测定 本实验采用Feton法中的分光光度法测定苋红素清除羟基自由基的能力[17]。将提取出的苋红素稀释成浓度分别为0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.10 mg/g的溶液(同时配制相同浓度的VC溶液)。试管中依次加入2 mL pH7.4 PBS缓冲液、1 mL 0.75 mmol/L邻菲罗啉溶液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1.5 mL样品液、0.5 mL 0.01%双氧水,混合均匀后于536 nm测定吸光度值A2;用等体积的蒸馏水代替样品液和双氧水,相同的方法测定吸光度值A0;不加样品液,用等体积的蒸馏水代替,测定吸光度值A1,按以下公式计算清除率:

式(3)

1.2.7.4 苋红素清除超氧阴离子自由基能力的测定 本实验采用邻苯三酚的自氧化作用建立超氧阴离子体系。

邻苯三酚自氧化速率的测定[22]:在试管中加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2,在37 ℃水浴锅中预热20 min)和4 mL蒸馏水,混匀后于37 ℃水浴锅中保温20 min后取出,立即加入0.5 mL已在37 ℃条件下预热的3 mmol/L邻苯三酚溶液,反应1 min后,迅速倒入比色皿中,以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作为对照,325 nm处每隔30 s测其吸光度。以时间为横坐标,吸光度值为纵坐标线性回归,其斜率为邻苯三酚自氧化的反应速率(V0)。

样品清除超氧阴离子自由基能力的测定[23]:将提取出的苋红素稀释成不同浓度分别为0.14、0.17、0.20、0.35、0.5、0.7 mg/g的溶液(同时配制相同浓度的VC溶液),按上述步骤,在加入邻苯三酚之前加入4 mL不同浓度的待测液代替蒸馏水。于325 nm处每隔30 s测定吸光度值,按相同的方法线性回归,曲线斜率记为V1。按以下公式计算抑制率:

式(4)

1.3数据处理

样品取样3次,进行实验。数据均取3次重复的平均值,采用IBM SPSS V 19.0软件分析实验数据,平均值的差异性用单因素方差分析(one-way ANOVA)中的Duncan’s检验,p<0.05为有统计学差异。使用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1提取溶剂种类对苋红素提取效果的影响

图1反映了不同提取溶剂对苋红素得率的影响,从图中可以看出,5种提取剂对苋红素得率依次为:50%乙醇>水>pH 6.0缓冲液>无水乙醇>2%盐酸。但由于苋菜叶片中的叶绿素能够溶于50%的乙醇中,而且叶绿素a的最大吸收光的波长在420～663 nm,叶绿素b的最大吸收波长范围在460～645 nm[24],会对苋红素的测定产生一定影响,综合考虑,选择水作为苋红素的提取剂。

图1 不同提取剂对苋红素提取效果的影响Fig.1 Effect of different solvent on extraction of amaranthin注:不同字母表示差异性显著。

2.2单因素实验条件优化

2.2.1 料液比对苋红素提取效果的影响 由图2可知,增加料液比可以显著提高苋红素得率,提高提取效果,当料液比达到1∶40时,苋红素已基本溶出,继续增大料液比,不但会增加溶剂的用量,而且会增大去除溶剂所需负荷,因此,从苋红素得率和节约成本两方面考虑,确定料液比为1∶40。

图2 不同料液比对苋红素提取效果的影响Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on extraction of amaranthin

2.2.2 提取时间对苋红素提取效果的影响 由图3可以看出,随着提取时间的延长,苋红素得率逐渐增多,在50 min时达到峰值,超过50 min后,苋红素得率开始下降,可能是因为部分色素在提取的过程中被分解,因此,苋红素得率的提取时间应控制在50 min左右为宜。

图3 不同提取时间对苋红素提取效果的影响Fig.3 Effect of different time on extraction of amaranthin

2.2.3 提取温度对苋红素提取效果的影响 图4反映出提取温度对苋红素得率的影响,当温度低于30 ℃时,苋红素得率随提取温度的升高而平缓增大,但当温度超过30 ℃时,随温度的升高苋红素得率呈下降的趋势,温度超过50 ℃时,由于色素热稳定性较差,在高温下产生分解而导致苋红素得率急剧下降。因此,苋红素的提取温度宜控制在30 ℃以下。

表3 回归模型的方差及显著性分析Table 3 Regression model of variance and significant analysis

图4 不同提取温度对苋红素提取效果的影响Fig.4 Effect of different temperature on extraction of amaranthin

注:*:差异显著,p<0.05;**:差异极显著,p<0.01。2.3响应面法优化苋红素得率提取工艺

2.3.1 响应面分析优化实验 表2中实验共17组,其中12组为析因实验,其余5组为中心实验,用于实验误差的估计,采用Design Expert软件对实验数据进行回归分析,得到苋红素得率关于提取时间(A),提取温度(B)和料液比(C)等因素的二次多项回归方程:

苋红素得率Y=-0.32871+0.073608A+0.087521B+0.011324C-2.0712×10-4AB-3.3333×10-4AC-3.68933×10-4BC-5.72493×10-4A2-9.96441×10-4B2+2.17149×10-4C2

表2 响应面优化实验设计及实验结果Table 2 Experimental design and results of optimizing test with response surface method

2.3.3 响应面的曲面分析 将提取时间,提取温度、料液比3个参数分别固定,苋红素得率随其余两个参数变化趋势如图5～图7所示。响应面中等高图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响,圆形表示二因素交互作用不显著,椭圆表示二因素交互作用显著[25]。

图5 提取时间和提取温度的响应曲面图Fig.5 Response surface plot of extraction time and extraction temperature

图6 提取时间和料液比的响应曲面图 Fig.6 Response surface plot of extraction time and solid-liquid ratio

图7 提取温度和料液比的响应曲面图Fig.7 Response surface plot of extraction temperature and solid-liquid ratio

提取温度和提取时间对提取出的苋红素得率呈近似椭圆形(图5),说明两者之间有交互作用,当提取时间一定时,苋红素得率随提取温度的升高呈现先增加后减小的趋势,在温度为30～35 ℃的范围内苋红素得率较好。当提取温度一定时,提取出的苋红素的量随提取时间的变化较小。而从图6、图7中的等高线可以看出,提取时间和料液比之间或者提取温度和料液比之间交互作用较小,可能是料液比在该实验范围内对苋红素得率影响较小。

通过回归模型的分析,可以确定苋红素得率的最佳工艺条件为提取温度为30.06 ℃、提取时间为44.34 min、料液比为1∶50。在此条件下,模型预测提取出的苋红素得率为3.08 mg/g。为方便实际操作,将工艺条件修正为温度为30 ℃、时间为44 min、料液比为1∶50。为检验该响应面优化方法的可靠性,采用上述最佳条件测定苋红素得率,实际得到的苋红素得率为3.05 mg/g,与理论预测值相比误差为0.98%。因此,采用响应面优化苋红素得率的工艺条件阐述准确可靠,具有实用价值。

2.4苋红素抗氧化性研究

苋菜中苋红素的抗氧化性研究结果如图8所示。由图8(A)可知,苋红素和VC都具有较好的抗氧化能力,并且随着浓度的增加,抗氧化能力越来越强,当浓度高于0.15 mg/g时,两者的抗氧化能力都趋于平衡,随浓度变化不大。在实验浓度范围内苋红素的抗氧化能力均高于VC。结合总抗氧化能力标准曲线可以得出0.15 mg/g苋红素溶液的抗氧化能力相当于0.09 mmol/L FeSO4,而相同浓度的VC溶液则相当于0.07 mmol/L FeSO4溶液。

图8(B)反映出苋红素对DPPH自由基的清除能力。在0.1～0.55 mg/g的范围内,苋红素对DPPH自由基的清除能力随其浓度的增加而增强,超过0.55 mg/g后,清除能力随浓度变化不大。而VC作为对照,在其浓度介于0.1～0.45 mg/g时,其清除能力显著低于(p<0.05)苋红素,继续提高其浓度,两者清除效果相当且变化不大。DPPH自由基清除力的大小通常用半清除率(IC50)表示,IC50是当清除率达到50%时所需要的抗氧剂浓度[22]。因此,根据清除率拟合曲线得到苋红素和VC的IC50分别为0.18 mg/g和0.40 mg/g。

苋红素对羟基自由基的清除作用如图8(C)所示。苋红素和VC都具有良好的清除羟基自由基的能力,在低浓度时,VC对羟基自由基的清除效果要优于苋红素,随着浓度的增加,当浓度大于0.06 mg/g时,苋红素的清除能力反而高于VC,但二者的清除率都趋于平衡,随浓度的增加变化不大,与郝秀梅[26]等研究结果一致。根据清除率拟合曲线得到苋红素和VC的IC50分别为0.06 mg/g和0.11 mg/g。

与王宁[27]等研究结果相似,在浓度低于0.6 mg/g时,苋红素对超氧阴离子自由基的清除作用强于VC,且随着浓度的增加,清除率也随之增大。当浓度高于0.6 mg/g时,VC的清除能力超过苋红素(图8D)。根据清除率拟合曲线得到苋红素和VC的IC50分别为0.35 mg/g和0.48 mg/g。

图8 苋红素抗氧化性研究结果Fig.8 Results of study of amaranthin antioxidant注:A:总抗氧化能力;B:DPPH自由基清除率;C:羟基自由基清除率;D:超氧阴离子自由基清除率; “**”和“*”分别表示相同浓度的VC与苋红素溶液的抗氧化性在 0.01水平(双侧)和0.05水平(双侧)上显著相关。

3 结论

利用响应面优化法得到提取苋菜中苋红素的最佳工艺条件为H2O作为提取剂、提取时间为44 min、提取温度为30 ℃、料液比为1∶50。影响提取最显著的因素是提取温度,其次是提取时间,最后是料液比。在此最优条件下,苋红素得率为0.305%。苋红素具有较好的抗氧化能力,其对DPPH自由基的清除率及总抗氧化能力均优于相同浓度的VC溶液,对羟基自由基以及超氧阴离子自由基的清除率也与VC相差不大。研究得出,0.15 mg/g苋红素提取液的总抗氧化能力相当于0.09 mmol/L FeSO4,对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的IC50分别为0.18、0.06和0. 35 mg/g。

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Responsesurfacemethodologyforoptimizingextractionofamaranthinanditsantioxidantactivity

XIONGQian,WANGChun-xing,SUNMeng,WANGKai-kai,SONGJia-min,XUFeng*,WANGHong-fei

(College of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

AmaranthustricolorL.;amaranthin;response surface methodology;antioxidant activity

2016-12-30

熊茜(1991-)，女，硕士研究生，研究方向:农产品贮藏加工,E-mail:13646621631@163.com。

*通讯作者:许凤(1983-)，女，博士，副教授，研究方向:农产品贮藏加工,E-mail：xufeng1@nbu.edu.cn。

国家自然科学基金青年科学基金项目(31301574)；浙江省自然科学基金项目(Y16C200011)；浙江省科技厅项目(2014C02023)；宁波市自然科学基金项目(2015A610273)；宁波大学人才引进项目(ZX2012000031)；宁波大学学科项目(xkl1344)；宁波大学校科研基金项目(XYL14025)；宁波大学学科项目(xkzsc1526)。

TS255.1

:B

:1002-0306(2017)12-0221-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.040