基于结构糖组学的食源性糖蛋白研究进展

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(1.渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062;3.西北大学生命科学学院功能糖组学实验室,陕西西安710069)



基于结构糖组学的食源性糖蛋白研究进展

赵文竹1,陈月皎1,张宏玲1,于志鹏1,*,刘静波2,于汉杰3,励建荣1,*

(1.渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062;3.西北大学生命科学学院功能糖组学实验室,陕西西安710069)

糖蛋白是一类具有多种功能的重要化合物,其糖链结构复杂,功能多样,在生物体内参与多种细胞活动。糖组学是继基因组学和蛋白质组学后又一新兴领域,而结构糖组学作为糖组学的重要组成部分,主要用于分析糖蛋白的结构。本文介绍利用结构糖组学相关技术在食源性糖蛋白糖链结构以及糖基化位点研究中的应用,旨在为结构糖组学在糖蛋白结构解析中的广泛应用提供依据。

糖蛋白,糖链,糖组学,结构糖组学

聚糖是第三类生物信息大分子,其较高的复杂性取决于组成聚糖的单糖种类繁多并且每种单糖都有各种形式的异构体以及不同的糖苷键连接方式。结构的多样性使聚糖在生物信息方面比蛋白质和核酸更具影响力,在生物体中发挥着其他生物分子不可替代的作用,而且因其不是基因的直接产物,关于糖生物功能和蛋白质糖基化功能在蛋白质组学和基因组学领域下无法阐述清楚。21世纪初期,“糖组”和“糖组学”的概念被提出[1]。糖组被定义为单一生物体内全部聚糖的总称[2],类似于基因组和蛋白质组。糖组学是研究糖复合物和糖链结构功能的科学,其综合系统地研究糖链结构、糖链形成的分子机制以及糖链功能。

蛋白质的糖基化即糖链修饰是蛋白质翻译后的重要修饰之一,细胞中50%以上的蛋白质具有糖链,糖链在生命活动中发挥着生物信息分子的重要作用。目前,食源性糖蛋白的研究日益增多,主要集中在糖蛋白的提取和分离纯化方面,但对糖链结构方面的研究较少,阻碍对糖蛋白功能活性的深入研究。本文主要介绍糖组学以及应用结构糖组学研究方法解析食源性糖蛋白糖链结构信息,旨在为食源性糖蛋白活性及构效关系的研究提供理论依据。

1 糖组学的研究进展

1958年,Crick提出生物中心法则,生物信息从DNA→RNA→蛋白质,其中核酸主要存在于细胞核内,这主要就是细胞核内的信息交流。细胞和细胞之间的交流主要是依靠细胞表面或细胞分泌的物质因子,糖链就存在于细胞表面的膜蛋白、糖脂或分泌蛋白上。研究发现细胞发育、分化、细胞免疫、微生物感染、肿瘤转移等细胞之间的生物现象都与细胞表面的糖链相关[3-7]。糖组学是对全部聚糖的全面分析且主要针对糖蛋白,侧重研究糖蛋白糖链结构和功能。糖组学主要解决基因信息、糖基化位点信息、聚糖结构以及糖基化功能四个方面的问题[8]。糖组学根据侧重点不同分为结构糖组学和功能糖组学,其中结构糖组学主要侧重于结构分析,功能糖组学偏重于功能研究[9]。

1.1结构糖组学

结构糖组学主要研究内容是蛋白质的糖基化位点和糖链结构分析。蛋白质糖链结构分析涉及到糖蛋白的提取分离和糖链结构的鉴定等。糖链结构测定远比核酸和蛋白质要困难,因糖链不均一性和含量甚微而备受挑战[10-12]。糖链的完整序列难以通过一种方法来完成,需要多种手段组合以确定糖链的结构信息。糖链结构分析上的突破将为糖蛋白的功能分析提供技术支持,利用结构糖组学的多元化策略和技术表征糖蛋白糖链空间构象,将为糖蛋白糖链空间构象解析提供一个新的思路。

1.2功能糖组学

功能糖组学为功能糖蛋白质组学研究提供理论基础[13-15]。目前,在糖蛋白质组学、糖组学下可以鉴定糖链并得出部分结构信息,但不能提供关于糖链功能的信息。因此,为了全面阐明糖组的功能将功能糖组学的研究方法引入进来[16]。微阵列技术是目前研究功能糖组学的重要手段[9],2002年首次被用于研究糖生物学[17]。微阵列技术主要将聚糖以共价连接的方式固定在具有化学反应活性表面的玻璃芯片上,通过高通量扫描技术分析糖分子与其它生物分子之间的相互作用,研究聚糖在生物体内的功能与作用机制。微阵列技术主要包括糖库的建立,样品的固定以及标记的检测和数据处理四个步骤。其中糖库的建立方法同基因库和蛋白质库的建立方法相似,糖分子的固定主要包括共价连接和非共价吸附两种类型。微阵列技术检测需求样品量小,可同时对成百个样品进行检测分析。

但目前微阵列技术仍处于发展的初级阶段,在固定糖分子的玻璃芯片的选择上和检测技术的敏感性等方面还需进一步发展。

2 结构糖组学的研究方法

结构糖组学应用于糖蛋白等高度异构体且具有多个分支的化合物的结构分析,其在分析糖蛋白糖链结构方面主要有四种关键技术。

2.1多维液相色谱法

多维液相色谱法(multi-dimensional liquid chromatography,MDLC)采用2-氨基吡啶荧光标定[18]。该方法不仅用于中性N-聚糖的二维映射[19],现也已被应用到聚糖(包括酸性聚糖)的三维映射[20]中。MDLC分离原则主要依据聚糖化学结构的不同,聚糖的正相色谱分离基本取决于其分子量大小,反相色谱分离则基于其疏水性。阴离子交换色谱法是分离酸性聚糖的方法。MDLC因峰重叠少,峰容量大,分辩率高,选择性好等优势成为分离纯化糖链的重要手段,也是当前糖链结构分析的主流技术[21]。MDLC与常规糖苷酶协同处理相比其单独作用更有效且适用于各种吡啶基胺聚糖[20]。

2.2质谱技术

质谱技术(mass spectrometry,MS)可以精确测量生物大分子的分子量并提供其分子结构信息。基于MS结合其它技术在糖蛋白、糖肽、糖链分析中扮演越来越重要的作用,其可以测定糖基化位点,单糖组成,糖链序列(图1)等[22]。电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorptionionization,MALDI)的“软电离”特性适合于高极性、难挥发、热不稳定的物质分析[23]。它们各有特色但也存在局限性。ESI-MS具有很高的灵敏性,可以分析高达20000 Da大分子，也可以分析小于1000 Da小分子[24]。但ESI-MS易受样品和溶剂中干扰物的影响。MALDI-MS也可用于分析大分子物质,对干扰物的忍受力强,并且在谱图上碎片峰少,易于解析结构,但在解吸过程中易造成较弱的键断裂,从而部分糖链结构丢失,丢失的糖链可能会有重要的生物活性,因此,ESI-MS和MALDI-MS不能完全解析糖蛋白的糖链结构。近年来,对于复杂聚糖结构分析首先通过串联质谱技术实现,即为MSn[25-26]。MSn技术就是进行多次质谱联用,从样品中选择母离子进行逐级轰击分析,不受其他物质干扰,所获得的糖链结构信息更加详尽。因为个别聚糖倾向于显示一个特性的模式,通常在高达到MS3或者MS4的过程下被有效地分化,每级MS只提供了一组质核比(m/z)值,用于解释理论上可能的组合物[27]。目前,通过建立标准糖串联质谱库进行比较相关糖链,从而达到确定糖链结构的目的。

图1 质谱技术在分析糖蛋白应用总结Fig.1 An overview of glycoprotein characterization techniques by MS

2.3毛细管电泳

毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)与传统的电泳技术相比主要特点在于其需要在散热效率极高的毛细管内进行。它在分析糖蛋白方面是非常有效的工具。相对于传统的糖基化研究需要高纯度糖蛋白样品而言,毛细管电泳具备最明显的优势就是能分离混合物[28]。它要求较高的理论塔板数(>100000),在测定的速度和灵敏度上都有巨大的优势,同时毛细管技术要求样品的用量很少,一般只需要纳升级的进样量。但是毛细管电泳技术也有一些缺陷,一个是它需要在毛细管壁上吸取待处理样液,因而,需要开发和应用有效的毛细管壁的材料。另外对分析生物样品中低浓度的蛋白质的灵敏度不高,需要结合MS一起使用[29]。应用MS高敏感性的特点作为CE的检测器,CE-MS具有高敏感性,高分辨率的特点,在测定多糖分子量,组成分析以及纯度鉴定方面应用广泛。另外CE也可与激光诱导荧光系统(LIF)联合使用,尽管CE-LIF不能直接用于检测聚糖结构,但CE-LIF主要用于分离聚糖的同分异构。

2.4凝集素

凝集素(agglutinin)主要是从植物、动物、微生物中分离具有特异性糖结合活性的蛋白。凝集素最大的特点就是可以识别糖蛋白、糖脂以及细胞膜上复杂结构的糖链,并且一种凝集素只能与一种糖链特异性结合[30]。不同的糖肽需要找不同的凝集素结合,如,刀豆凝集素(convalina agglutinin,Con A)富集高甘露糖型的糖肽、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)富集末端含有N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸的糖肽、橙黄网胞盘菌凝集素(aleuria aurantia lectin,AAL)能富集岩藻糖的糖肽等[31]。凝集素已广泛用于聚糖的富集和鉴定,并在不同组分不同类型的聚糖研究中得到了应用[32]。Kasai将外源凝集素与前沿亲和色谱(frontal affinity chromatography,FAC)结合[33],FAC提供聚糖和凝集素连接强度的数值,随着自动化FAC系统的出现,处理样品能力大大提高,凝集素特异性结合糖系统的数据可以被迅速积累,并且凝集素的特异性以Kd值的方式体现也比以往的方式更系统[34-35]。

凝集素芯片技术的出现对应用糖组学研究复杂的聚糖结构的高通量、高灵敏性的鉴定提供了方便[36],其原理就是将凝集素固定在经醛基化、环氧化或其他方式修饰过的玻璃芯片上,再用荧光标记的凝集素与样品杂交,检测阳性信号,分析对应的寡糖结构,从而达到鉴定糖链结构的目的[37]。凝集素芯片技术在鉴定某一特定类型的糖链结构或者糖链连接键等方面有优势,但其只能检测部分结构信息,这并不能判断出该糖链结构存在于哪种聚糖中。

糖组学研究的相关技术在分析糖链结构方面都有其独特的优点,但也都存在弊端。MDLC、MS、CE、FAC在分析糖蛋白糖链结构时,都需要对样品进行处理,除去对待测糖链有影响的糖链,这样会消耗大量的时间和人力。凝集素芯片技术在操作前不需处理样品,并同时分析多组样品,操作时间短,准确性高,分析后的样品还可用于后续分析,但此技术芯片上的凝集素种类还不够完善,不能分析复杂的糖链结构,在鉴定方面没有达到标准化、规范化,并且凝集素获得的信息不够完善。使用糖组学的单一技术研究可能会遇到很多困难,因此采用糖组学多元化策略鉴定糖链结构。多维液相色谱法可以进行多维分离,分离的更彻底,与质谱法联用自动化程度高,重复性好;外源凝集素技术在测定糖链结构方面也一直受到青睐。凝集素鉴定糖链结构具有特异、敏感、快速的特点,将凝集素与FAC结合使用,可以提高糖链回收率,在解析混合糖链也有较好的效果。

3 结构糖组学的应用

食源性糖蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、防衰老等功效[38],目前提取食源性糖蛋白方法主要有水浸提法、有机溶剂提取法和酸碱溶液提取法等[39-41],糖蛋白的分离纯化大多采用DEAE离子交换和Sephadex凝胶层析法,并通过紫外分光光度计和红外光谱等技术鉴定单糖组成的一级结构[42-43]。目前结构糖组学在食源性糖蛋白及其他领域的成功运用为糖蛋白的纯化及结构解析提供了新的解决策略。

3.1结构糖组学相关技术在食源性糖蛋白中应用

质谱技术早已在医药、临床、化学和化工领域应用广泛,现将质谱技术和毛细管技术结合应用在糖链结构方面的研究。Hilz等从黑色板栗中提取木糖葡聚糖,经内切葡聚糖酶降解后应用CE-ESI-MSn分析鉴定葡聚糖的结构[44];Zamfir等采用CE-ESI对含有硫酸皮肤素/软骨素的寡聚糖进行分析,鉴定了所含二糖的种类和结构[45]。孙伟等从生药枸杞中提取枸杞多糖,利用电喷雾电离二级质谱以及串联质谱技术,分析出其包含19条N-糖链且都是中性糖[46]。最近有研究者利用CE-LIF技术将NBD-F作为荧光标记物分析人类转铁蛋白,牛胎球蛋白以及人类α-1酸性糖蛋白中N-糖链(图2)[47]。李玲梅等人用聚丙烯凝胶电泳法分离大豆糖蛋白,回收出现的蛋白质条带并释放凝胶中的N-糖链,标记糖链,应用ESI-MS、MSn、液相色谱-串联质谱联用分析糖蛋白,确定15条蛋白质条带,其中7条是低聚甘露型聚糖,2条是α-1,3核心岩藻聚糖,6条是没有聚糖修饰的蛋白质,并对后续研究糖蛋白糖基化位点和大豆糖蛋白生物活性提供基础[48]。质谱技术对待测样品要求不高,可以是气体、液体,也可以是固体,每次测定样品用量少,灵敏度高,尤其是MSn可以对样品多级测定,准确性高,能分析相对分子量较大的物质,相信MS在未来糖链结构的鉴定会有更好的应用。

图2 CE-LIF分析寡糖结构Fig.2 Capollary electrophoresis with laser-induced fluorometric detection of NBD-F-labeled oligosaccharides注:(a)人体血清转铁蛋白、(b)牛胎球蛋白、(c)人类α-1酸性糖蛋白中提取的寡糖。

3.2结构糖组学相关技术在其他方面的应用

结构糖组学技术在其他领域也有广泛的应用,其中凝集素技术在生物学方面一直是热点技术,有研究利用ConA、晶状体凝集素(lentil lectin,LCH)、雪花凝集素(sonwdrop lectin,GNA)3种植物凝集素组成亲和层析柱分离纯化N-连接糖蛋白,进行二维电泳、图像分析、质谱分析确定肝癌细胞表达规律[49]。齐义军等应用植物凝集素亲和层析法从血清中富集寡甘露糖型、唾液酸型的N-连接糖蛋白及O-连接的糖蛋白,通过加入ConA、LCH、GNA于Poly-Prep层析柱内制备寡甘露糖型糖蛋白;利用琼脂糖偶联的麦胚凝集素WGA、接骨木凝集素(elderberry lectin,SNA)、马鞍树凝集素(maackia amurensis lectin,MAL)于Poly-Prep层析柱内富集唾液酸型N-连接糖蛋白;通过花生凝集素(peanut agglutinin,PNA)和木菠萝凝集素(Jacalin)于Poly-Prep层析柱内富集唾液酸型O-连接糖蛋白,最后应用MS检测,确定所获得的14个糖蛋白均为N-连接糖蛋白[50]。邹宁等利用凝集素分析患者血清中高甘露糖表达量,研究高甘露糖型糖蛋白在不同疾病中的表达规律[51]。在生物体系中糖蛋白绝对丰度低,富集糖蛋白是研究糖组学的基础,也是目前研究的瓶颈,使用凝集素亲合层析法富集糖蛋白是目前研究者首选的技术,但目前已知的凝集素种类并不全面,并不能结合所有糖蛋白,所以凝集素的开发也是未来的焦点。凝集素芯片技术主要应用在糖蛋白的检测和细胞表面糖结构的检测。Pilobello等用凝集素芯片技术鉴定卵清蛋白结构,证明凝集素芯片能够区分糖链的不同连接方式并检测出不同样品的糖结构,之后陆续开发出检测细胞表面糖结构的芯片以及检测糖蛋白结构的产品QproteomeTMGlycoArray kits,并且应用在快速检测糖蛋白糖链结构上[52]。

4 结论与展望

解析糖蛋白糖链结构、阐明糖链功能以及获得更多的生物学信息,对日后开发抗肿瘤、抗病毒、抗感染等功能性食物、药物方面起到重要的促进作用。糖链不同于有模板可循的核酸和蛋白质,因此,鉴定糖链结构和糖基化位点是食源性糖蛋白研究的难点。糖基化鉴定的难点在于糖链是大分子而且存在微观不均一性,同时糖链在串联质谱中碎裂且与肽段的碎裂规律不同,导致蛋白质组学的质谱解析方法和软件难以完整地鉴定肽段序列和糖链结构。结构糖组学是研究糖基化位点的有效手段:利用N-糖酰胺酶切除糖链后鉴定N-糖基化位点;通过电子转运裂解鉴定糖肽肽段;将高能碰撞裂解与电子转运裂解联用或碰撞诱导裂解与三级质谱联用鉴定完整N-糖肽。

多维液相色谱法,软电离质谱技术,凝集素芯片等结构糖组学研究方法的出现为鉴定糖链结构和糖基化位点提供了新途径。但质谱技术、色谱技术等样品消耗量大,时间长,而凝集素法由于其特异性识别糖蛋白,可以减少预先对糖链分离步骤,从而缩短时间,但凝集素技术并不适用于所有糖蛋白糖链的解析,不具备普遍性。因此,将结构糖组学研究技术协同运用进而准确解析食源性糖蛋白的糖链结构以及糖基化位点是未来研究的焦点。

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Progressoffood-derivedglycoproteinsbasedonthestructuralglycomics

ZHAOWen-zhu1,CHENYue-jiao1,ZHANGHong-ling1,YUZhi-peng1,*,LIUJing-bo2,YUHan-jie3,LIJian-rong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Bohai University,Jinzhou 121013,China; 2.Laboratory of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China; 3.Laboratory for Functional Glycomics,College of Life Sciences,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Glycoprotein is an important compound,and glycan possess more diverse structure and more functions which makes glycan to take part in various activities. Glycomics especially structural glycomics as an emerging field that follows the genomics and proteomics,focusing on analyzing glycoprotein structure. The passage mainly introduced the application of structural glycomics on the aspect of glycan structure and glycosylation sites in foodborne glycoprotein,which hoped provide the reference for subsequent research.

glycoproteins;glycan;glycomics;structural glycomics

2017-01-10

赵文竹(1986-)，女，博士，讲师，研究方向：果蔬生物活性成分的结构与功能研究，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。

*通讯作者:于志鹏(1984-)，男，博士，讲师，研究方向：功能蛋白与活性肽的结构及功能研究，E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。 励建荣(1964-)，男，博士，教授，研究方向:水产与果蔬加工，E-mail：ljr64@163.com。

国家自然科学基金青年项目(31601479)。

TS201

:A

:1002-0306(2017)12-0333-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.062