味精废水培养汉逊德巴利酵母的自溶条件优化

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(1.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430000; 2.国家粮食局科学研究院,北京 100037)



味精废水培养汉逊德巴利酵母的自溶条件优化

喻轶1,2,陈园2,黎琪2,赵晨2,刘玉春2,陈新1,张晓琳2,*

(1.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430000; 2.国家粮食局科学研究院,北京 100037)

为了优化酵母细胞的自溶条件、提高细胞自溶的效果,本研究以味精废水为培养基,能耐高硫铵的汉逊德巴利酵母为原料,以细胞内容物溶出率为响应值,在时间、温度、pH、促溶剂种类的单因素实验基础上,利用响应面法优化细胞自溶条件。结果表明,汉逊德巴利酵母自溶的最佳条件为:自溶时间为23 h,自溶温度为54 ℃、pH为5.5、木瓜蛋白酶的添加量为0.8%;在该条件下酵母自溶液中氨基酸态氮含量为14.76 g/L,与最佳预测值14.84 g/L较为接近。说明该模型可靠,响应面法优化酵母细胞自溶可行,可用于指导生产实践。

汉逊德巴利酵母,味精废水,自溶,响应面优化

酵母菌属于真菌类单细胞生物,生长周期短,安全性高,是食品发酵、酒精发酵、微生物合成等工业化生产中常用的工业菌株[1]。除此以外,酵母细胞富含蛋白质、核酸、矿物质、维生素以及脂肪、糖、酶、β-葡聚糖、甘露聚糖等多种营养成分[2-4],通过生物技术手段改造后,可用于重组蛋白、饲料添加剂、酵母抽提物等的生产开发中[5]。但在酵母利用的过程中由于其坚固的细胞壁,使得酵母中的大部分营养成分很难释放,大大降低了利用率,因此常常需要对其进行破壁处理。

预处理常用的方式有酶解法、酸处理、酵母自溶[6]。酶解法通常采用烘干后失活的酵母为原料,添加葡聚糖酶、蛋白酶、核酸酶等一系列酶制剂将细胞壁分解成小分子的糖、氨基酸、肽类,需要多种酶制剂协同作用,所需成本较高,我国仅在生产高档酵母抽提物时使用该方法,使用范围较小[7]。酸处理同样采用烘干后的酵母为原料,利用浓硫酸脱水后再进行过滤、脱色、碱中和,产品中游离氨基酸含量高,但在中和过程中产生大量的盐,之后仍需要进行脱盐处理,工艺较为复杂[8]。自溶法是采用活性酵母为原料,利用自身含有的酶系,如蛋白酶系、核酸酶系、水解酶系等,将细胞壁水解为氨基酸、小肽、还原糖等并从细胞内抽提出来[9]。但由于内源酶活性有限,仅通过其自身溶解往往不够,通常通过改变外界环境,如温度、pH、添加促溶剂等方法促进酵母自溶。该方法水解得到的自溶物中风味游离氨基酸含量较高,成本低,操作简便,在我国和欧美使用较为广泛[10-11]。

本研究选用实验室筛选的耐高浓度硫酸铵的汉逊德巴利酵母,以味精废水中的氨氮生长,并转化为菌体蛋白。通过自溶法破壁酵母细胞,使细胞内容物溶出。先通过单因素实验,探索酵母自溶的时间、温度、pH、酶的添加量范围,并采用响应面法对工艺进行优化,得到预测模型和最佳的自溶条件,获得酵母自溶物,实现废弃物的资源再利用。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

味精废水 企业提供；汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)ASAGFY 31 由实验室分离筛选,其保藏编号为CGMCC No. 11237;PDA培养基 马铃薯(去皮)200 g、20 g/L葡萄糖,121 ℃灭菌15 min;无水乙酸钠、乙酸、37%甲醛、氯化钠、乙酰丙酮、苯酚、硫酸、无水硫酸铜、硫酸钠、氢氧化钠、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、氯化钡、三氯乙酸等 均为分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司;木瓜蛋白酶(酶活力10000 U/g)、β-葡聚糖酶(酶活力10000 U/g) 均为食品级,北京索莱宝科技有限公司。

M-105型电热恒温水槽 太仓精密仪器设备有限公司;5810R型台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;QC208型涡旋振荡器 美国Labnet公司;ISFI-X型UV2350紫外分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司;QCD-3型凯氏定氮仪 丹麦福斯(Foss)公司;水浴锅 太仓精密仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 酵母培养、分离及处理 在味精废水中接种2%酵母，30 ℃下培养60 h,取酵母发酵液(湿重16.2%,干重3.5%,活菌数6.7×108CFU/mL),控制自溶条件(自溶时间、温度、pH、促溶剂种类及添加量)进行自溶,然后将发酵液在100 ℃沸水浴中灭酶15 min后,4000 r/min离心15 min,分别测定氨基酸态氮含量和细胞内容物溶出率,衡量酵母自溶效果[5]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 时间对酵母细胞自溶的影响 取1.2.1项预处理中后的发酵液,在pH为5,温度为55 ℃条件下考察不同的自溶时间(4、8、12、16、20、24、28 h)对酵母细胞内容物溶出率和氨基酸态氮含量的影响。

1.2.2.2 pH对酵母细胞自溶的影响 自溶时间为20 h,温度为55 ℃,考察不同pH(4、4.5、5、5.5、6、6.5、7)对酵母细胞内容物溶出率和氨基酸态氮含量的影响。

1.2.2.3 温度对酵母细胞自溶的影响 在自溶20 h,pH为5条件下考察不同温度(45、50、55、60、65 ℃)对酵母细胞内容物溶出率和氨基酸态氮含量的影响。

1.2.2.4 促溶剂对酵母细胞自溶的影响 在自溶20 h,温度为55 ℃,pH为5的条件下,添加不同种类的促溶剂:NaCl(添加1%、3%、5%、7%、9%),木瓜蛋白酶(添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%),β-葡聚糖酶(添加0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%)，考察其对酵母细胞内容物溶出率和氨基酸态氮的影响。

1.2.3 CCD中心组合实验设计 根据单因素实验范围和选择对酵母自溶影响显著的木瓜蛋白酶进行4因素5水平的CCD中心组合实验,实验因素及水平如表1所示。

表1 响应面设计实验因素水平编码表Table 1 Independent variables and levels of response surface design

1.2.4 测定指标及方法

1.2.4.1 氨基酸态氮的测定 取1.2.1预处理后上清液,采用比色法[12],绘制硫酸铵的标准曲线为y=0.0089-0.0017x,R2=0.9994,线性范围在0～200 μg/mL,并计算酵母自溶后发酵液中氨基酸态氮含量。

1.2.4.2 细胞内容物溶出率测定 按照1.2.1中,将上清液烘干至恒重,并按照下面公式计算细胞内容物溶出率[13]。

细胞内容物溶出率(%)=上清液烘干后的质量/酵母细胞干质量× 100

1.2.4.3 多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[14]。取1.2.1中预处理离心后的上清液,缓慢加入4倍体积乙醇,充分混合后离心取上清液,沸水浴30 min,冷却至室温后过滤,取上清为待测样品。以葡萄糖为标品建立标准曲线,将0.1 g/L葡萄糖标准溶液按0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL加入试管中,再向各个试管中加蒸馏水至2 mL,加入1 mL的5%苯酚溶液和5 mL浓硫酸后沸水浴30 min后于490 nm处测定吸光度,绘制葡萄糖标准曲线为y=0.0097x,R2=0.9984,线性范围在0～1 mg/mL。以此方法测定酵母自溶前后溶液中多糖含量。

1.2.5 数据处理 实验数据采用Origin 8.5软件作图,Design-Expert 8.0.6软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1 时间对酵母自溶的影响 酵母细胞自溶死亡之后胞内的水解酶系才能发挥作用,因此细胞的自溶需要一定的时间[15]。由图1可知,氨基酸态氮和细胞内容物溶出率随时间的增加逐渐升高,在20 h时两者均达到最大值,随后氨基酸态氮含量有所下降,细胞内容物溶出率基本维持不变,因此细胞自溶的最佳时间为20 h。

图1 时间对酵母自溶的影响Fig.1 Effect of time on yeast autolysis

2.1.2 pH对酵母自溶的影响 自溶过程是在其内源酶的作用下进行的,细胞生长环境pH直接影响到内源酶的活性大小,并诱导细胞代谢紊乱,引发酵母细胞自溶[16]。图2所示,当pH为4～5时,氨基酸态氮和细胞内容物溶出率随pH的升高而增加;pH为5时,氨基酸态氮和细胞内容物溶出率均为最高,之后随pH升高反而降低,可能是pH过高抑制了酵母细胞内源酶的活性,故自溶最佳pH选择5。

图2 pH对酵母自溶的影响Fig.2 Effect of pH on yeast autolysis

2.1.3 温度对酵母自溶的影响 温度对于细胞自溶也有一定程度的影响。由图3可看出,随着温度的增加,55 ℃时氨基酸态氮和溶出率达到最大值,可能是温度影响了酵母内源酶的活性,同时细胞膜结构发生变化,破坏细胞器的完整性,导致酵母自溶[16]。故选择细胞自溶的最佳温度为55 ℃。

图3 温度对酵母自溶的影响Fig.3 Effect of temperature on yeast autolysis

2.1.4 NaCl添加量对酵母自溶的影响 在酵母自溶过程中添加一定浓度的NaCl可以改变细胞渗透压,当NaCl浓度达到一定程度时可加速细胞质的水解作用,促进酵母细胞自溶[17]。从图4中可知,氨基酸态氮含量和细胞内容物溶出率随NaCl添加浓度的增加均有上升,当添加量为3%时两者达到最大值,氨基酸态氮含量最高为9.81 g/L,细胞内容物溶出率为43.45%,随后开始下降,可能是NaCl浓度过高抑制了细胞内源酶的活性,导致其随着NaCl浓度的增加反而开始降低[13]。故NaCl的添加量最佳为3%。

图4 NaCl添加量对酵母自溶的影响Fig.4 Effect of NaCl addition on yeast autolysis

2.1.5β-葡聚糖酶添加量对酵母自溶的影响 影响酵母细胞自溶的一个主要原因是其坚固的细胞壁,细胞壁主要由β-葡聚糖构成,因此添加一定浓度的β-葡聚糖酶有助于水解细胞壁中的β-葡聚糖,使细胞壁溶解引发酵母自溶[18]。由图5可知,随着酶添加量的增加,氨基酸态氮和细胞内容物溶出率逐渐增加,在0%～0.3%浓度范围内,两者随浓度的增加而上升;在0.3%～0.9%时氨基酸态氮增加平缓,在0.5%时达到最大为11.11 g/L,随后保持基本不变,而细胞内容物溶出率当β-葡聚糖添加量在0.3%～0.7%时,随着添加量的增加反而下降,在0.3%处达到最大值为45.45%。从经济效益角度考虑,选择β-葡聚糖酶的最佳添加量为0.3%。

图5 β-葡聚糖酶添加量对酵母自溶的影响Fig.5 Effect of β-glucanas addition on yeast autolysis

2.1.6 木瓜蛋白酶对酵母自溶的影响 外加蛋白酶可以降解酵母细胞壁和细胞膜表面的蛋白,增大细胞壁孔隙,并将细胞内的大分子蛋白水解为可以通过孔隙的小肽和氨基酸,溶进自溶液中。研究显示。以木瓜蛋白酶的降解效果最好[19]。由图6可知,添加木瓜蛋白酶组氨基酸态氮和细胞内容物溶出率均高于对照组,当添加量在0%～0.6%时,氨基酸态氮和细胞内容物溶出率随酶的添加量增大而增加,在0.9%时氨基酸态氮达12.34 g/L,随后保持基本不变,当添加量为0.6%时细胞内容物溶出率为47.88%。考虑到实际经济效益故木瓜蛋白酶的最佳添加量为0.6%。

图6 木瓜蛋白酶添加量对酵母自溶的影响Fig.6 Effect of papain addition on yeast autolysis

2.2响应面实验

2.2.1 响应面实验设计 根据单因素实验的结果分析,选择对酵母细胞自溶的影响较为显著的自溶时间(A)、温度(B)、pH(C),在所选促溶剂中木瓜蛋白酶的效果最为显著,因此另选择木瓜蛋白酶添加量(D)为考察因素,由前期预实验知,相比于细胞内容物溶出率,自溶液中氨基酸态氮含量能较好利用CCD模型进行模拟,因此以3次测得的氨基酸态氮的平均值为响应值,进行响应面实验设计,结果如表2所示。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

根据软件Design-Expert 8.0.6利用回归法分析实验结果,得到时间(A)、温度(B)、pH(C)和木瓜蛋白酶添加量(D)4个因素对氨基酸态氮(Y)的表征编码方程如下:Y=14.51+0.52A-0.2013B+0.032C+0.26D+0.12AB+0.32AC+0.082AD-0.11BC-0.31BD-0.086CD-0.52A2-0.52B2-0.48C2-0.35D2

由表3可知,模型p<0.0001,表明该方程误差小,模型极显著,能够用此方程来代替真实实验点分析结果,决定因素R2=0.922,表明响应值氨基酸态氮实际值与预测值之间有较高的拟合度,该模型能够反映响应值变化。其中失拟项p>0.05,失拟不显著该模型可靠。时间(A)对氨基酸态氮影响极显著,温度(B)、木瓜蛋白酶含量(D)对其影响显著,pH(C)对其影响不显著。时间与pH的交互作用(AC)对氨基酸态氮的影响显著,温度与木瓜蛋白酶添加量的交互作用(BD)对氨基酸态氮的影响显著,时间的二次项(A2)、温度的二次项(B2)、pH的二次项(C2)、木瓜蛋白酶添加量的二次项(D2)对拟合方程结果有极显著的影响。

2.2.2 响应面分析 图7～图12直观给出了各个因子间的交互作用的响应面图和等高线图,响应面坡度直接反应两者交互作用的显著性,坡度越陡则两者交互作用越显著。等高线也反应了两个因素交互作用的大小,越接近椭圆表示两者交互作用越显著,越接近圆形则反应交互作用越不显著。由图7可知,随着温度和时间的增加,氨基酸态氮含量随时间的增加先增加后降低,当温度过高或过低时影响酵母细胞内源酶活力,其中响应曲面较为平缓,等高线接近圆形,说明两者交互作用不显著。由图8可知,响应曲面比较陡峭,表明两者交互作用较为显著,等高线沿时间方向较为密集,说明时间对氨基酸态氮含量影响较为显著,氨基酸态氮含量随pH和时间的增加先增加后降低,说明pH过高或自溶时间过长都不利于内源酶的水解作用。

图7 温度与时间的交互作用对氨基酸态氮的影响Fig.7 Effect of temperature and time on amino nitrogen

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

图8 pH与时间的交互作用对氨基酸态氮的影响Fig.8 Effect of pH and time on amino nitrogen

注:**差异极显著,p<0.01;*差异显著,p<0.05。由图9显示的时间与木瓜蛋白酶的交互作用，可以看出,随酶的添加量和时间的增加,氨基酸态氮含量先增加后降低,当木瓜蛋白酶添加量为0.6%,自溶21 h后氨基酸态氮含量最高,等高线沿时间和木瓜蛋白酶含量方向均不密集,且接近圆形,说明两者交互作用不显著;由图10可知,随着温度和pH的继续增加,氨基酸态氮含量反而逐渐减少,过高或过低的pH都有可能抑制内源酶和木瓜蛋白酶的协同作用。响应曲面较为平缓,等高线接近圆形说明两者交互作用不显著。

图9 木瓜蛋白酶与时间的交互作用对氨基酸态氮的影响Fig.9 Effect of papain and time on amino nitrogen

图10 pH与温度交互作用对氨基酸态氮的影响Fig.10 Effect of pH and temperature on amino nitrogen

由图11可知,等高线呈椭圆,响应曲面坡度较陡,说明木瓜蛋白酶的添加量和温度的交互作用对酵母自溶作用显著。增加木瓜蛋白酶添加量和升高温度都能使氨基酸态氮含量先增加后降低。由图12可知,木瓜蛋白酶添加量和pH的响应曲面较为平缓,等高线接近圆形,说明两者之间的交互作用不显著,且对氨基酸态氮的影响程度相近。

图11 木瓜蛋白酶与温度交互对氨基酸态氮的影响Fig.11 Effect of papain and temperature on amino nitrogen

图12 木瓜蛋白酶添加量与pH交互对氨基酸态氮影响Fig.12 Effect of papain and pH on amino nitrogen

2.2.3 模型验证 用Design-Expert 8.0.6软件对回归模型进行分析,得到自溶时间为22.6,温度为53.5 ℃,pH为5.6,木瓜蛋白酶添加量为0.75%。考虑到实际操作中的可行性得到最优工艺组合:自溶时间为23 h,温度为54 ℃、pH为5.5、木瓜蛋白酶的添加量为0.8%;按照此参数进行验证实验，得验证值为14.76 g/L,预测值为14.84 g/L,相对偏差为0.8%,与预测值较为接近。

邵伟等人添加NaCl和酶制剂酵母自溶后,自溶液中氨基酸态氮含量为5.92 g/L[20],陶兴无采用添加复合酶方法对酵母进行破壁,破壁后自溶液中氨基酸态氮含量比破壁前溶液中提升了11.6%[21]。曾俊华等用超声法对细胞进行破壁,当超声频率在24 Hz,时间13 min时破壁率为65%,自溶液中氨基酸态氮含量为8.82 g/L[22]。和文献报道的结果相比较,本实验中优化的条件能较为有效的使酵母细胞破壁自溶。

2.3酵母自溶物中营养成分测定

酵母细胞自溶液中含有多种营养成分,分别测定酵母细胞破壁前和破壁后溶液中的成分含量,结果见表4。

表4 自溶前后氨基酸氮和粗多糖含量测定Table 4 Amino nitrogen and polysaccharides before and after autolysis

由表4可知,酵母细胞破壁处理后氨基酸态氮提高了14.82%,粗多糖的含量提升了14.68%,说明该方法对诱导细胞自溶释放细胞内溶物有一定效果。

3 结论

采用响应面分析法对酵母自溶条件参数进行优化,综合考虑酵母自溶的实际操作性,最佳条件为自溶时间23 h、温度54 ℃、pH5.5、木瓜蛋白酶的添加量为0.8%。在此条件下氨基酸态氮含量为14.76 g/L,比细胞破壁前提高了14.82%,粗多糖含量为7.03 mg/mL,比自溶前提高了14.68%。本研究以味精废水为培养基成分之一培养酵母,实现了废弃物资源的二次利用,自溶工艺对工业化生产具有一定的指导意义。酵母破壁后其中的功能性成分(核酸、核苷酸、小肽)对动物的营养和免疫具有促进作用[23],也为酵母自溶物作为动物饲料提供了新的思路。

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OptimizationofDebaryomyceshanseniiautolysisconditionthroughwastewaterfrommonosodiumglutamate

YUYi1,2,CHENYuan2,LIQi2,ZHAOChen2,LIUYu-chun2,CHENXin1,ZHANGXiao-lin2,*

(1.Wuhan Polytechnic University Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan 430000,China; 2.Academy of State Administration of Grain,Beijing 100037,China)

To optimize the cell autolysis processing ofDebaryomyceshanseniicultured in monosodium glutamate waste water,the response surface methodology was used in this study. The cell lysis rate was considered as response value of the response surface methodology,which was based on single factors experiment of time,temperature pH and cosolvent. The obtained optimal conditions were time 23 h,temperature 54 ℃,pH5.5,papain 0.8%.Under the condition,the content of amino acid nitrogen in the yeast cell lysis solution was 14.76 g/L,which was close to the predicted optimal value 14.84 g/L. The model was reliable and the strategy for optimization of yeast cell autolysis was feasible,which could be applicable for guiding production practices.

Debaryomyceshansenii;monosodium glutamate wastewater;autolysis;response surface optimization

2016-11-28

喻轶(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：微生物资源与应用，E-mail：wuhanyuyi@126.com。

*通讯作者:张晓琳(1975-)，女，博士，研究员，研究方向:微生物资源开发，E-mail：zxl@chinagrain.org。

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金课题(ZX1504)。

TS201.2+5

:A

:1002-0306(2017)12-0140-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.026