核定位信号肽和转运肽对斑马鱼转基因效率的影响

钟继汉,沈 丹,陈 才,高 波*,宋成义

(1.扬州大学 农业与农产品安全国际合作联合实验室,江苏 扬州 225009;2.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

核定位信号肽和转运肽对斑马鱼转基因效率的影响

钟继汉1,2,沈 丹2,陈 才2,高 波1,2*,宋成义1,2

(1.扬州大学 农业与农产品安全国际合作联合实验室,江苏 扬州 225009;2.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

为了探讨核定位信号肽S413-PV和转运肽Tp10这2种融合肽对转基因效率的影响，将S413-PV和Tp10与线性化质粒分别以质量比50∶1、100∶1、200∶1混合制成转染液，注射斑马鱼单细胞期胚胎，分别检测转染24 h、120 h后胚胎的阳性率和成活率。结果表明：与对照组相比，转染24 h后，S413-PV组胚胎阳性率极显著上升，胚胎成活率均下降，但差异不显著； Tp10组阳性率均呈上升趋势，200∶1组差异极显著，其他组差异不显著，胚胎成活率均显著下降；转染120 h后，S413-PV组胚胎阳性率均极显著上升，胚胎成活率均呈下降趋势，100∶1、200∶1组差异极显著；Tp10组胚胎阳性率上升，200∶1组差异显著，胚胎成活率均极显著下降。以上结果表明，S413-PV可显著提高斑马鱼转基因效率，对胚胎毒性较小；Tp10对转基因效率影响不显著，且对胚胎毒性较强。

核定位信号肽; 转运肽; 基因转移； 斑马鱼

细胞穿膜肽 (cell penetrating peptides,CPPs) 是一系列通过耗能或非耗能形式跨过多种细胞膜的小分子多肽 (其长度一般不超过30个氨基酸)[1]。研究发现，CPPs能够有效地将小分子药物、蛋白质、肽类、核酸片段以及纳米载体 (如脂质体、聚合物胶束、无机纳米粒等) 转运穿过细胞膜。CPPs种类较多，主要包括转运肽(transit peptides)[2]、核定位信号肽(nuclear localization signal，NLS)[3]等。NLS是一段富含精氨酸、赖氨酸的氨基酸序列，存在于真核细胞核蛋白和病毒蛋白中，具有引导定位核区的功能，利用含核定位信号肽的非病毒载体为基因转移提供了新的途径。NLS能够提高基因入核效率已经在细胞上得以证实，James等[4]研究表明，大分子DNA的入核效率较小分子、单链DNA分子低，而利用NLS可以提高大分子DNA入核效率，其原理是NLS能够引导其所携带的DNA分子特异地趋向核区，识别核孔，然后进入细胞核。这一发现具有重要的学术价值和医学应用前景，引起了学术界的广泛关注，在基因治疗领域陆续研发出了多种融合肽，并对其序列构成进行了修饰改进，其中S413-PV、Tat等融合肽具有很好的基因转移效果[5]。S413-PV为由21个氨基酸残基组成的融合肽，包含穿膜肽和核定位信号肽序列[6]。此外，功能类似的转运肽在细胞转染和基因治疗上也取得很好的应用效果，如Transportan 10(Tp10)[7]。S413-PV和Tp10均能够有效介导蛋白质、DNA和RNA等多种分子高效入核[8]，在细胞转染和基因治疗领域应用较为广泛，但在制备转基因动物中应用较少。斑马鱼作为模式生物具有产卵量大、发育快、生长周期短等优点[9-10]，对制备转基因动物的研究具有重要意义。

如何将外源基因有效导入细胞核并整合至基因组是制备转基因动物的关键环节，为了提高基因组整合效率，转座子、CRISPR/Cas9和TALEN等基因修饰技术已在各种动物上应用广泛[11-15]，并取得较为满意的遗传修饰效果。鉴于此，为提高转基因效率，利用核定位信号肽S413-PV和转运肽Tp10，以模式生物斑马鱼为研究对象，探讨融合肽在动物体内的转基因效果，以期为转基因动物的制备提供一种简便有效的方法。

1 材料和方法

1.1 供试模式生物

斑马鱼由国家斑马鱼资源中心提供。斑马鱼饲养在循环水箱中，温度28.5 ℃，每天光照14 h。

1.2 载体及试剂

多转座子重组载体pT3-FAG-GFP由扬州大学表观遗传学与表观基因组学研究所构建保存。商品化核定位信号肽Tp10(SP-15-0033-01)和S413-PV(SP-15-0034-01)购自英国CAMBRIDGE公司；去内毒素DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司；E3培养液、氨苄青霉素(Ampicillin)、T4 DNA 连接酶、DNA Marker λ-HindⅢ、DNA Marker DL15000、DNA提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、高保真酶及其他分析纯级生化试剂均购自宝生物工程有限公司。

1.3 转染注射液制备

将pT3-FAG-GFP质粒用SmaⅠ酶切进行线性化处理， S413-PV、Tp10分别与线性化处理的质粒按质量比50∶1、100∶1、200∶1混合，DNA的注射质量浓度为20 ng/μL。

1.4 试验分组及胚胎注射

试验设S413-PV处理组、Tp10处理组、对照组，S413-PV处理组、Tp10处理组注射1.3中制备的转染液，对照组仅注射质粒无融合肽。每组3个重复，每组注射胚胎数均在150枚以上。注射前一天晚上，取4尾母鱼、2尾公鱼于繁殖盒中，隔板隔开培养，第2天将隔板拿开，公鱼追逐母鱼即开始交配产卵，自产卵开始计时10～15 min后收集受精卵，水温控制在28.5 ℃，将收集的受精卵置于体视显微镜下进行胚胎显微注射。将上述注射液注射至斑马鱼单细胞期胚胎，将注射后的胚胎置于含有E3 培养液的平皿中培养，每24 h换液一次，注射后24 h和120 h应用体视正置荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白表达情况，统计阳性胚胎数和成活胚胎数，计算胚胎阳性率和胚胎成活率。

胚胎阳性率=GFP阳性胚胎数/被检测活胚胎数×100%；

胚胎成活率=被检测活胚数/注射胚胎总数×100%。

1.5 数据统计及分析

试验数据进行单因素方差分析，应用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 2种融合肽对斑马鱼基因转移效率的影响

将显微注射的斑马鱼受精卵培养至120 h，检测荧光表达情况，对照组、S413-PV、Tp10处理组均能观察到荧光表达，但不同组间GFP阳性胚胎数量存在差异(图1)。分别测定培养24 h、120 h后阳性胚胎数及2种融合肽的转基因效率，结果显示，转染24 h后，融合肽与线性化质粒在质量比为50∶1、100∶1、200∶1时，S413-PV组胚胎阳性率分别为62.37%、76.60%、85.78%，Tp10组的胚胎阳性率分别为33.18%、35.78%、40.00%，对照组胚胎阳性率为32.32%；转染120 h后，S413-PV组的胚胎阳性率分别为66.92%、81.70%、86.94%，Tp10组胚胎阳性率分别为36.13%、38.70%、45.00%，对照组胚胎阳性率为35.01%。统计结果表明，与对照组相比，转染24 h后， S413-PV组胚胎阳性率均极显著上升，Tp10组胚胎阳性率均呈上升趋势，质量比200∶1组差异极显著；转染120 h后， S413-PV组胚胎阳性率均极显著上升，Tp10组胚胎阳性率上升，质量比200∶1组差异显著(图2)。

A1、A2为S413-PV与质粒质量比100∶1组；B1、B2为Tp10与质粒质量比100∶1组；C1、C2为对照

不同大写字母代表差异极显著(P<0.01)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)，下同

2.2 2种融合肽对斑马鱼胚胎毒性的影响

将显微注射的斑马鱼受精卵培养120 h，检测胚胎成活情况。融合肽与线性化质粒在质量比为50∶1、100∶1、200∶1时，转染24 h后，S413-PV组胚胎成活率分别为87.54%、83.36%、77.19%，Tp10组胚胎成活率分别为73.07%、66.48%、61.21%，对照组胚胎成活率为84.85%；转染120 h后，S413-PV组胚胎成活率分别为67.10%、64.26%、60.00%，Tp10组胚胎成活率分别为59.34%、54.35%、49.99%，对照组胚胎成活率为74.02%。统计结果表明，与对照组相比，转染24 h后， S413-PV组胚胎成活率下降，但差异不显著，Tp10组胚胎成活率均显著下降；转染120 h后， S413-PV组胚胎成活率均呈下降趋势，质量比100∶1、200∶1组差异极显著，Tp10组胚胎成活率均极显著下降(图3)。可见，S413-PV对胚胎毒性较小。

图3 斑马鱼显微注射后24 h和120 h的胚胎成活率

3 结论与讨论

本研究结果表明，核定位信号肽S413-PV可以显著提高斑马鱼的基因转移效率，在制备转基因斑马鱼研究中具有应用前景；而转运肽Tp10对斑马鱼的基因转移效率影响不显著，且Tp10的毒性较S413-PV高。

核定位信号肽可以有效地提高基因转移的效率，因此，核定位信号肽可以应用于转基因动物、基因治疗和细胞转染等研究中，也可以辅助制备疫苗提高免疫效果。James等[4]的研究证实，细胞核核孔的大小是固定的，DNA分子进入细胞核的数量与DNA分子的大小密切相关，DNA分子越大进入细胞核的量就越少，而通过NLS介导可以明显提高DNA的入核效率。如今，改进的NLS已经成为非常重要的非侵入性的细胞输入载体，并已作为药物载体成功地应用于体外和体内治疗。Collas等[16]发现，SV40病毒中大T抗原的核定位信号肽在斑马鱼单细胞胚胎中能够提高DNA入核效率，并促进报告基因的表达。与转座子和CRISPR/Cas9等相比，在进行基因导入研究时，核定位信号肽介导技术具有简单快速等特点，不需要复杂的载体改造，尤其在介导大片段DNA时具有优势。S413-PV由N端和C端功能肽序列2部分组成，N端13个氨基酸为细胞穿膜肽序列，来源于蛙的抗菌肽DS4，C端的7个氨基酸为核定位信号肽序列，来源于SV40病毒大T抗原。本研究利用核定位信号肽S413-PV和转运肽Tp10，以模式生物斑马鱼为研究对象，探讨融合肽在动物体内的转基因效果，研究结果表明，核定位信号肽S413-PV可极显著提高斑马鱼转基因效率，且对胚胎成活率影响小。

转运肽Tp10最先是由Langel等[17]学者设计的融合肽，包括2部分功能肽序列，由神经肽甘丙肽的N端的12个氨基酸和通过赖氨酸残基连接的14个氨基酸的蜂毒肽组成，为了降低其毒性，删除N末端6个氨酸残基形成了Tp10。本研究结果表明，转运肽Tp10对斑马鱼的基因转移效率影响不显著，且Tp10的毒性较强。

核定位信号肽S413-PV可显著提高斑马鱼转基因效率，对制备转基因动物具有非常重要的意义。转运肽Tp10则对斑马鱼的基因转移效率影响不显著，不建议使用。

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Effect of Nuclear Localization Signal Peptides and Transit Peptides on Gene Transfer Efficiency in Zebrafish

ZHONG Jihan1,2,SHEN Dan2,CHEN Cai2,GAO Bo1,2*,SONG Chengyi1,2

(1.Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-product Safety,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 2.College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

In order to study effect of nuclear localization signal S413-PV and transport peptides Tp10 on gene transfer efficiency,the synthetic NLS peptide S413-PV or transport peptide Tp10 was mixed with li-nearized plasmid harbouring green fluorescent protein(GFP) expressing cassete at the mass ratio of 50∶1,100∶1,and 200∶1,respectively.Then the mixture was injected into 1-cell stage fertilized eggs of zebrafish.GFP positive efficiency and the survival rate of embryos were detected at 24 hours post fertilization(hpf) and 120 hpf stages.The results showed that the GFP positive rate of embryos in S413-PV groups were significantly higher than that in the control group both at 24 and 120 hpf stages.There were significant differences between the different ratio.The GFP positive rate of embryos was highest at the ratio of 200∶1.The GFP positive rates of embryos in Tp10 groups were also higher than that in the control at 24 and 120 hpf.And the GFP positive rate of embryos at the ratio of 200∶1 was significantly higher than that in other groups at 24 hpf.The survival rate of embryos either in S413-PV or Tp10 was lower than control.The rate decreased with the peptides ratio increased.The survival rate of embryos in S413-PV groups at the ratio of 100∶1 and 200∶1 were significantly lower than that in other groups at 120 hpf.The survial rate of embryos in Tp10 groups were significantly lower than that in control group both at 24 and 120 hpf stages.These data suggested that S413-PV could significantly improve the transgenic efficiency in zebrafish and had a little effect on the survival rate of embryos.While Tp10 had no significant effect on transgenic efficiency,and had higher toxicity to embryos.

NLS peptide; transit peptide; gene transfer; zebrafish

2016-12-22

国家自然科学基金项目(31671313、31572364)

钟继汉(1990-)，男，山东枣庄人，在读硕士研究生，研究方向：分子标记与遗传育种。E-mail：978096325@qq.com

*通讯作者：高 波 (1975-)，女，江苏连云港人，副教授，博士，主要从事分子生物学方向教学及科研工作。 E-mail:bgao@yzu.edu.cn

Q78;S813.3

A

1004-3268(2017)06-0142-05