牡丹根际微生物的研究进展

杨瑞先，王祖华，赵梓轩，李嘉珏

(1.洛阳理工学院 环境工程与化学学院,河南 洛阳 471023； 2.中国洛阳国家牡丹基因库，河南 洛阳471011)

牡丹根际微生物的研究进展

杨瑞先1，王祖华1，赵梓轩1，李嘉珏2

(1.洛阳理工学院 环境工程与化学学院,河南 洛阳 471023； 2.中国洛阳国家牡丹基因库，河南 洛阳471011)

牡丹连作障碍严重危害牡丹的生长发育，其形成原因复杂，最新研究显示，牡丹连作障碍与根际微生物菌群结构的变化具有一定的相关性。根据近年来国内外关于牡丹与根际微生物互作的研究成果，对牡丹根际微生物的多样性、牡丹与根际微生物的相互作用、牡丹连作障碍与根际微生物的关系等方面的研究进展进行综述，提出了今后牡丹根际微生物方面需要深入研究的几个问题，以期从根际微生物种群动态变化的角度认识牡丹连作障碍的原因并为其防治提供思路。

牡丹； 根际微生物； 连作障碍

1904年，德国微生物学家Lorenz Hiltner首次提出了“根际(rhizosphere)”这一概念，用以描述植物根系分泌物对土壤微生物的影响[1]。根际是指植物根系周围，受到根系分泌物影响的狭小土壤区域，其理化特性以及生物学活性明显不同于原土体[2]。由于根系微环境的影响，生活在该区域的微生物会受到根系的影响，其微生物的丰度和多样性在不同植物间具有较大差异。根际微生物数量巨大，种类多样，根际微生物的基因组被称为宏基因组，如同人体肠道微生物组，根际微生物组好比植物的第2套基因组，对植物的生长发育、养分获取、植物病虫害防御和产量提升起着至关重要的作用[3]。牡丹根际微生物既包括改善生长状况的有益微生物，也包括抑制牡丹生长的有害微生物，如造成牡丹连作障碍的土传病原菌等。近年来，关于牡丹根际微生物的研究也逐渐增加。主要从牡丹根际微生物的多样性、牡丹与根际微生物的相互作用、牡丹连作障碍与根际微生物的关系等3个方面进行综述，并指出了牡丹根际微生物研究前景，以期从根际微生物种群动态变化的角度认识牡丹连作障碍的原因，并为其防治提供思路。

1 牡丹根际微生物的多样性

牡丹根际微生物的种类主要包括细菌、真菌和放线菌，目前研究者多采用分离和纯培养的方法进行牡丹根际微生物多样性研究。研究表明，采用纯培养方法可以获得丰富的牡丹根际微生物。目前，从牡丹根际土壤中分离到的可培养细菌和真菌主要类群见表1。研究发现，可培养细菌的优势属主要为假单孢菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)和贪食菌属(Variovorax)[4]，可培养真菌的优势属主要为青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、单孢枝霉属(Hormodendrum)和盘多毛孢属(Pestalotia)[5]。

表1 牡丹根际微生物的主要类群

近年来，随着分子生态技术的迅速发展，对环境16S rRNA基因和ITS基因进行的大量研究表明，植物根际微生物的种群多样性远比传统方法估计的要高，同时非培养方法能够更真实地反映根际微生物的群落结构[6]。目前，研究者采用非培养方法获得的牡丹根际微生物种群见表1。Xue等[7]采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法研究了牡丹根际中细菌种群结构变化，结果表明，牡丹根际细菌具有丰富的多样性，其29个DGGE代表性条带测序结果表明，牡丹土壤根际细菌主要归于7个门和1个未知种类，优势属仍为假单孢菌属和芽孢杆菌属；郑艳等[8]采用454 焦磷酸测序技术，分析了牡丹皮五产区药用牡丹根际真菌的种群多样性，药用牡丹根际土壤真菌主要归于5个门，不同地区其优势属的种类不同。以上研究均表明，牡丹根际微生物种群组成具有丰富的多样性，且纯培养和非培养方法获得的根际优势种类基本相同，如芽孢杆菌属和假单孢菌属细菌，但采用非培养方法获得的牡丹根际种群组成更为丰富。

牡丹根际微生物中细菌除类群具有多样性外，还存在数量多样性及根际土壤微生物数量要比非根际土壤微生物数量高的特点，在对牡丹的非根际土壤、根际土壤和根表细菌进行分离时发现，牡丹根际土壤细菌的种群数量达到108cfu/g，而非根际土壤和根表细菌的种群数量仅为107cfu/g[4]，这可能与牡丹根际更为复杂的环境条件有极大的相关性，其种群更为丰富的机制也需做进一步的研究。

2 牡丹与根际微生物的相互作用

2.1 牡丹对根际微生物的影响

根系分泌物是植物与根际微生物相互作用的中间媒介，吸引微生物在植物根际聚集生长成为根际微生物，同时又为微生物提供重要的营养和能量来源，其种类和数量直接影响着根际微生物的代谢和生长发育，进而对根际微生物的种类、数量和分布产生影响[9-10]。牡丹根系分泌物和脱落物成分相当复杂，主要是糖类、氨基酸、维生素、微生物生长的刺激或抑制物质等，其成分的微小变化即可引起根际微生物区系组成上的巨大差异[11]。药用植物能够产生丰富的次级代谢产物，如黄酮、生物碱、萜类、蒽醌、酚类等，在植物生长过中很容易释放到土壤中，从而引起药用植物根际土壤理化性质的改变，导致根际微生物种群结构的变化[12]。牡丹作为药用植物，其根皮晒干后即为丹皮，为常见的药材，牡丹根皮中含有多种药用成分，丹皮酚为牡丹根皮中的主要成分[13]。康业斌等[5]研究证实，牡丹根皮中丹皮酚的含量与根际细菌的数量呈负相关，即丹皮酚含量越高，其根际微生物数量越少；不同的牡丹品种其根皮中的丹皮酚含量不同，凤丹根皮中丹皮酚的含量(24.688 g/kg)高于洛阳红(13.024 g/kg)，但凤丹根际微生物的数量明显低于洛阳红，该研究结果表明，根系分泌物的含量直接影响根际细菌的数量。

除了根系分泌物影响牡丹根际微生物的丰度之外，有研究者发现，牡丹种植年限也影响根际微生物群落结构的变化，牡丹种植年限越长，其根际土壤中细菌和真菌群落结构多样性水平就越低[14]。同时，土壤类型也直接影响植物根际微生物的种群构成。郑艳等[8]研究发现，来自不同产区的凤丹根际土壤真菌构成存在差异性，其中道地产区铜陵和南陵的真菌组成更为丰富，而3个非道地产区亳州、菏泽和洛阳的真菌组成较为相似，其种群多样性低于道地产区，结果表明，不同地区的土壤类型不同，从而影响牡丹根际真菌的种群结构和多样性。

2.2 根际微生物对牡丹生长的影响

微生物对植物的作用是多方面的，在根际微生物区系中，主要体现在微生物分泌激素对整株植物具有促生作用、根际微生物的分解和转化作用及对植物病害的生防作用。目前有研究表明，来自安徽铜陵凤丹根际的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CSM1101能够有效拮抗牡丹葡萄孢菌(Botrytispaeoniae)、牡丹枝孢霉菌(Cladosporiumpaeoniae)和芍药杂色尾孢霉菌(Cercosporavariicolor)菌丝的生长，且利用此菌液浸泡牡丹种子后，种子的生根率和发芽率显著提高，同时对牡丹幼苗也有明显的促生作用[15]。除了防病促生作用外，根际微生物也能够分解和转化土壤中一些微量元素，促进植物对各种元素的吸收，如植物根际的固氮菌、解磷菌、铁细菌和硫细菌等都可促进植物转化和吸收各种元素。研究者从牡丹根际细菌中筛选获得了25株解磷菌，其中1株假单孢菌(Pseudomonassp.)FLR2的溶磷能力可达到326.2 mg/L，在牡丹的栽培管理中具有极其重要的应用价值，值得进一步开发应用[16]。尽管牡丹根系对根际微生物菌群的选择机制仍然未知，但以上研究均表明，牡丹根际微生物对维持牡丹健康和土壤肥力具有重要的生态学意义。

3 牡丹连作障碍与根际微生物的关系

同一种植物或近缘植物在同一块土地上连续多年种植以后，即使在正常管理情况下，也会出现生育状况变差、病虫害严重、产量降低、品质变劣的现象，称为连作障碍[17]。研究者认为，连作障碍主要是由于单一作物多年连续种植导致植物—土壤负反馈作用的结果[18]。牡丹连作障碍主要表现在2个方面：一是在多年种植的牡丹观赏园中，牡丹植株的生长势逐年衰弱，开花量降低，病虫害发生严重且防治困难，甚至出现大片植株死亡的现象；二是在牡丹种苗种植基地栽种牡丹后，再次种植牡丹会出现牡丹种苗缓苗慢、生长势差、根系不发达等现象[19]。目前，连作障碍已成为阻碍牡丹生产的一个重要因素，牡丹连作障碍形成及加重发生的原因是复杂的，其中重要的影响因素主要包括根际微生物群落结构失调和根系分泌物引起的自毒作用。

3.1 牡丹连作导致根际微生物群落结构失衡

植物连作会导致土壤理化性状、根际微生物群落结构朝着不利于植物生长发育的方向发展[20]。部分研究表明，根际微生物群落结构的失衡是导致牡丹连作障碍的原因之一，Xue等[7]发现，牡丹根际土壤中和固氮有关的细菌以及和有机化合物降解有关的细菌种类，如慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium)和鞘氨醇单孢菌(Sphingomonas)等随牡丹种植年限的增加而消失，表明牡丹根际土壤中有益细菌数量随着牡丹种植年限的增加而逐年减少。康业斌等[5]同时研究发现，牡丹根际真菌多样性随着种植年限的增加也出现减少的趋势，牡丹种植年限越长，土壤真菌多样性水平就越低，种群结构也趋于简单，因此，推测牡丹种植年限影响牡丹根际微生物的种群结构，其年限越长，有益微生物数量越少，从而影响牡丹的生长发育状况。

目前的研究结果均表明，牡丹种植年限越长其根际微生物种群结构就越趋于简单，有益菌的数量逐渐减少。随着有益微生物数量的减少，土壤中某些病原菌数量却逐年累积增加，如引起牡丹根腐病的镰刀菌在土壤中大量存在，造成病害严重发生。除了土传病害，其他一些病害的病原菌残留在植物残体上，随着耕作或其他传播条件，逐年严重发生，因此，牡丹病原菌数量的逐年增加也是牡丹连作障碍的主要原因。研究者认为，植物根际分泌物及植株残体为病原菌的生长和繁殖提供了充足的营养，植物根系分泌物能够促进病原真菌孢子萌发并诱导其大量定殖在连作土壤中，最后形成以病原菌大量增殖、微生物多样性显著降低为特征的连作土壤微生物群落[21-22]。牡丹根际分泌物是否能够促进牡丹病原菌的增殖，抑制有益细菌的繁殖，目前并没有报道，需做进一步的研究和分析。目前，大多数药用植物连作障碍研究均表明，连作会使药用植物根际微生物从高肥力的“细菌型土壤”向低肥力的“真菌型土壤”转变，从而破坏根际微生物群落结构的平衡[23-24]，导致药用植物连作障碍的发生。牡丹根际微生物种群结构的变化是否如此，仍需做更多的研究。

3.2 牡丹自毒作用

牡丹存在连作障碍现象，但发现在古牡丹中加入活性炭有助于其生长，表明牡丹根际土壤中很可能存在对牡丹生长有毒害的物质，其连作障碍很可能与牡丹自毒作用有关。自毒作用是植物化感作用的一种重要表现形式，它是指同种植物的个体通过向环境释放某些代谢物或分解的化学物质而对其他个体生长直接或间接地产生影响[25]。研究发现，自毒物质主要来源于根系分泌和植物残体分解，丹皮中含有丰富的次生代谢物，如酚类及酚苷类、单萜及单萜苷类，其他成分还有三萜、甾醇及其苷类、黄酮、有机酸、香豆素等[26]，这些次生代谢物有很多是典型的化感物质，它们可以通过各种途径分泌到土壤环境中，对下茬牡丹植株产生影响。

郝青[27]采集生长年限为5、10、15、20、25、30 a的洛阳红根际土壤，分别制备其根际土壤浸出液，用根际土壤浸出液浇灌沙培的凤丹播种苗和2年生洛阳红分株苗，结果发现，不同连作年限的土壤浸出液对凤丹播种苗和洛阳红分株苗后期生长发育产生显著的影响，牡丹连作时间越长，其根际土壤对牡丹生长发育产生的影响越大，导致牡丹生长势减弱，即牡丹连作时间越长，其根际土壤浸出液产生的自毒物质对牡丹的生长发育影响越大，该研究从试验层次上证明了牡丹的连作障碍与牡丹的自毒作用密不可分。

为了进一步研究牡丹自毒物质的成分，找出对牡丹生长有毒害的物质，郝青[27]通过比较5、10、15、20、25、30 a 6个阶段土壤的化感成分，发现一些物质在幼年植株的根际土壤中未检出，而在老年植株的土壤中相对含量较高，这些物质可能由根系分泌至土壤中，从而对牡丹生长产生毒害作用。该研究证明了牡丹根际土壤和根系分泌物中存在自毒物质，这为解决牡丹主产区及牡丹专类园的连作障碍问题奠定了理论基础，但这些物质对牡丹生长的毒害程度和发生毒害的阶段，以及产生毒害的作用机制均需做进一步的研究和分析。同时自毒作用与土壤微生物种群变化之间的相互作用也需要做进一步的研究，以明确牡丹自毒物质造成牡丹连作障碍的作用机制及与根际土壤微生物群落结构之间的关系，进而从根本上解决牡丹连作障碍问题。

除了牡丹根际微生物群落结构失衡和牡丹根际分泌物产生的自毒物质外，牡丹长期连作导致土壤理化性质破坏。同时在牡丹栽培种植中长期单施、重施无机肥，有机肥使用较少。无机肥的长期过多使用也加重了土壤理化性状及结构的恶化，土壤板结、沙化、碱化、重金属严重超标等现象也日趋严重。除此之外，牡丹生长过程中对营养成分也具有选择性吸收的特点，造成土壤营养状况发生显著改变，重茬种植时，在营养上因供需比例不平衡，造成牡丹某种营养元素的缺乏，致使生理性病害发生严重，进而影响生长。如牡丹缺铁黄叶病主要是由缺铁而造成叶绿素受抑，严重时上部嫩叶全部黄化，铁元素是叶绿素形成的重要物质，当土壤中缺少能够吸收利用的铁元素时，叶绿素形成受抑，出现黄叶症，因此，在重茬种植的牡丹园内应适时补充铁元素以缓解土壤中铁元素的缺乏。

4 牡丹根际微生物研究前景

牡丹连作障碍的产生涉及诸多复杂的因素，其发生不是单一或孤立的，而是既相互关联又相互影响的。若只考虑某一单个因子来研究其产生机制是不合理的，因此，必须首先确定引起牡丹连作障碍的主导因子，进一步阐明主导因子的作用机制，才能真正地解决此难题。当然，不可否认，根际微生物群落结构的变化和牡丹根际分泌物引起的自毒作用是引起牡丹连作障碍的主要原因。目前，连作土壤根际微生态的变化已成为土壤生态学领域的研究热点，但在牡丹根际微生态的研究方面还存在着一些问题：(1) 在病原微生物方面，大多数研究更关注于牡丹病原真菌，对于病原细菌和线虫的研究比较欠缺，有可能细菌和线虫也是牡丹连作病虫害发生的主要原因，因此，需进一步加强该方面的研究；(2)关于牡丹根际微生物种群多样性的研究还远远不够，多数仅停留在纯培养阶段，因此，需开展更多的研究工作来探讨不同牡丹品种、环境条件、生长年限以及气候因子对牡丹根际微生物多样性的影响，以进一步了解牡丹根际微生物与牡丹生长发育的关系，为牡丹连作障碍中牡丹根际微生物是否为主导因子提供更多的理论依据。

分子生态学技术的发展打破了不可培养微生物研究的局限性，因此，在后续的研究工作中可充分利用高通量测序技术，全面深入地了解牡丹根际微生物群落结构，同时大量开发目前还未知的微生物资源，为牡丹根际微生物的开发利用奠定理论基础；同时可在牡丹种植前检测土壤微生物元基因组，了解是否有病原菌的存在，并针对不同病原菌采取不同的处理手段，从而达到预防和治疗土壤中因病原菌累积过多导致的牡丹连作障碍现象；除此之外，需对牡丹根际分泌物及沉积物与根际微生物之间的关系做进一步的研究和探讨，从而更进一步地明确根系分泌物如何影响根际微生物的种群结构，进而影响到牡丹生长发育状况。

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Advances in Rhizospheric Microorganism of Tree Peony

YANG Ruixian1,WANG Zuhua1,ZHAO Zixuan1,LI Jiajue2

(1.Department of Environmental Engineering and Chemistry,Luoyang Institute of Science and Technology,Luoyang 471023,China;2.Luoyang National Peony Gene Bank,Luoyang 471011,China)

The continuous cropping obstacle devastates tree peony growth and development,and its formation is complex.The latest research results revealed its close association with the changes of rhizosphere microbial community structure.In this paper,the latest results and trends about tree peony rhizosphere microbiome research were reviewed.This review summarized tree peony rhizosphere microbial diversity,interaction between tree peony and rhizosphere microorganisms,and the causes of tree peony continuous cropping obstacle.The relationship was comprehensively analysed between tree peony rhizosphere microorganism and continuous cropping obstacle.In summary,a new perspective for the causes of tree peony continuous cropping obstacle and possible prevention regimen had been arisen from better understanding the association between continuous cropping obstacle and the dynamic changes of rhizosphere soil microbial population.On this basis,the future research and development direction of rhizospheric microorganism of tree peony were proposed.

tree peony; rhizospheric microorganism; continuous cropping obstacles

2016-12-13

国家自然科学基金项目(31500008)；河南省教育厅科技攻关项目(14A180024)；河南省科技厅高新技术项目(152102210328)

杨瑞先(1979-)，女，河南洛阳人，讲师，博士，主要从事植物根际及内生微生物研究。 E-mail：fairy19790805@163.com

S685.11

A

1004-3268(2017)06-0029-05