高效液相色谱法测定维生素软糖中叶酸的含量

□ 郭丽仪 黄永连 梁咏瑜 赖文婷 广东省质量监督食品检验站；广东省食品工业研究所；广东省食品工业公共实验室

高效液相色谱法测定维生素软糖中叶酸的含量

□ 郭丽仪 黄永连 梁咏瑜 赖文婷 广东省质量监督食品检验站；广东省食品工业研究所；广东省食品工业公共实验室

本文建立了高效液相色谱法测定维生素软糖中叶酸含量的方法。结果可得出，该方法快速、可靠，可适用于维生素软糖中叶酸的含量测定。

叶酸；高效液相色谱；维生素

叶酸，是一种重要的B族维生素，天然存在于部分食物当中，也作为添加剂被适量加入到一些营养强化食品、保健食品中，准确测定叶酸含量对产品的生产加工、功效评价等有重要意义[1]。目前，市场上销售的营养素补充剂几乎都添加有叶酸［2］。有关叶酸分析的方法有荧光法[3]、电化学法[4]、微生物法［5］以及高效液相色谱法[6-7]。其中，以高效液相色谱法最为常用。叶酸在不同食物中的存在形式不一样，用一般的检测方法并不能进行提取分离和测定，而采用高效液相色谱法就可以把以不同形式存在的叶酸分开并进行定量分析。本实验中建立了用反相液相色谱测定维生素软糖食品中叶酸含量的方法和条件。在样品前处理和流动相进行了优化，试剂易得，价格便宜，方法操作更简单、快速，而且分离效果好，能满足维生素软糖中叶酸含量的检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

叶酸标准品（中国药品生物制品检定所）、甲醇（色谱纯）、碳酸钠（Na2CO3）、乙酸、乙酸铵、庚烷磺酸钠、三乙胺、冰乙酸、磷酸和纯水（除特殊注明外，本实验所用试剂均为分析纯）。

1.1.2 仪器

Agilent l200高效液相色谱系统、紫外检测器、Agilent SB-AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱和昆山牌超声波清洗仪KQ-500DE型。

1.2 色谱条件

Agilent SB-AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；色谱柱温度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：50.0 μL；检测波长：275 nm。所用试剂和溶液进入色谱系统之前经0.45 μm微孔滤膜压滤。

1.3 分析步骤

1.3.1 缓冲溶液的制备

称取90.0 g乙酸铵置于500 mL烧杯中，分别加入120 mL纯水和30 mL乙酸溶解并混匀。

1.3.2 提取液（0.1 mol/L Na2CO3）的制备

称取10.599 g Na2CO3置于1 L容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。

1.3.3 流动相D瓶

称取2.0 g庚烷磺酸钠，分别加入3.0 mL三乙胺和冰乙酸20 mL，用纯水定容至2 L，并用磷酸调节pH至2.5。

1.3.4 标准储备液的制备

精密称取叶酸标准品0.010 0 g置于100 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L Na2CO3溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 μm有机滤膜压滤，滤液作为标准品溶液，此溶液浓度为100 μg/mL。

1.3.5 标准曲线的绘制

分别取100 μg/mL标准储备液0.5、1.00、2.50、5.00 mL和10.00 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，各加入2 mL缓冲溶液，用0.1 mol/L Na2CO3稀释至刻度，此时标准使用液浓度分别为1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL和20.00 μg/mL。分别注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积，以叶酸浓度（x，μg/mL），对相应峰面积（y）进行线性回归，回归方程为：y=156.630 60x-5.184 10，r=1.000 00（n=5），结果叶酸浓度在1.000～20.00 μg/mL，线性关系良好，如图1所示。

1.3.6 供试品溶液的配制

精密称取样品2.012 3 g置于50 mL棕色容量瓶中，加入适量（约30mL）0.1 mol/L Na2CO3摇匀，超声30 min，加入2 mL缓冲液混匀，用0.1 mol/ L Na2CO3定容至刻度，充分摇匀，再经0.45 μm有机滤膜压滤，续滤液作为供试品溶液。样品色谱图，如图2所示。（注意事项：样品加入缓冲液之后，大多数会产生大量气泡。因此，在加入缓冲液之前，加入0.1 mol/L Na2CO3时不能加太多，而且加缓冲溶液一定要在超声之后，要控制好pH值，使提取完全；若有黑色样品，不可随意上机，会影响柱效。）

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的选择

叶酸在碱性条件下易溶且稳定性好，受热和见光也不会分解[8]，而其他水溶性维生素则在酸性条件下稳定，所以溶解样品时用0.1 mol/L Na2CO3溶液（选择Na2CO3的原因，比较稳定且存放时间长，避免了氨水的刺激性气味和易挥发的缺点），可以避免其他水溶性维生素的干扰。在实验中，分别比较常温30 ℃、40 ℃的提取效果。结果表明，30 ℃，提取30 min的条件可以得到满意的效果。

2.2 流动相的选择

2.2.1 流动相缓冲液pH的选择

在实验中，将流动相D的pH值分别调到2.0、2.5、3.0。结果表明，当pH为2.5时，在分离时间、分离效果上都比较好。峰形好，不拖尾。综合考虑保留时间和分离效率，所以选择流动相缓冲溶液为pH2.5。

2.2.2 流动相比例的选择

对于流动相D和甲醇的比例进行了反复实验，考察了流动相组成对保留时间的影响。随着甲醇比例的增大，保留时间缩短，柱效提高。同时，又因为甲醇比例太高，容量因子降低。梯度变化大则使柱效提高，但峰形的对称因子降低；梯度变化小则使保留时间延长，柱效降低。因此，考虑采用梯度洗脱的方法进行分离。梯度洗脱程序见表1。

2.3 检测波长的选择

取适量的标准液于紫外U-2 000中扫描，在275 nm处测得最大吸收，故实验采用275 nm作为检测波长。

2.4 含量的测定

使用外标法定量。标准曲线的绘制：取上述标准储备液上机，以标准储备液的峰面积（A）为横坐标，浓度（C）为纵坐标，绘制标准曲线。

结果计算：

式中：y为维生素软糖叶酸的含量，mg/100 g；C样为标准曲线计算出来的样品中叶酸的实际浓度；v为样品的定容体积，mL；f-1为样品的稀释倍数；m为样品的质量，g。

2.5 供试品溶液稳定性

取“1.3.6”项供试品溶液室温放置分别于0、3、6、9、12 h和24 h，进样50.0 μL，测定峰面积和记录色谱图，其结果的相对标准偏差（RSD）为1.72%（n=6）。表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好（结果见表2）。

图1 标准品色谱图

图2 样品色谱图

表1 梯度洗脱程序表

2.6 精密度试验

取“1.3.6”项供试品溶重复进样6次，以峰面积A计算样品的相对偏差（RSD）%，结果见表3。表3结果显示：维生素软糖叶酸RSD为1.63%，RSD＜3%，重复性良好。

3 结语

本实验通过控制缓冲液pH，梯度洗脱测定维生素软糖中的叶酸含量，在1.00～20.00 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系（r＝1.000 00）。该方法前处理简单，试剂易得，分析时间较短，灵敏度高，可用于维生素软糖中叶酸的含量测定。

[1]罗建波.保健食品中叶酸的高效液相色谱测定法[J].职业与健康,2003(9):36-37.

[2]邓富良,陈本美,饶均明,等.高效液相色谱法测定血浆中左亚叶酸钙的含量[J].分析化学(医学期刊),2005(7):8-9.

[3]刘保生,王云科,张彦青,等.铽－环丙沙星稀土敏化荧光猝灭法测定叶酸[J].分析化学研究简报,2007(7):1067-1070.

[4]肖路延,王萌,朱明炜,等.电化学发光法测定血清叶酸[J].中国临床营养杂志,2007(2):75-78.

[5]马景宏,张旭,王为黎,等.微生物分析法测定保健食品叶酸[J].中国微生态学杂志,2007(6):576-577.

[6]李碧琳,宋晓东.用反相离子对色谱分离和检测水溶性维生素十二烷基磺酸钠作离子对试剂[J].分析化学,1991(8):886.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部.2000年版）[M].北京:化学工业出版社,2000.

[8]王存芳.高效液相法测定注射用亚叶酸钙中的有关物质[J].中华中西医杂志,2004(19):11-12.

表2 稳定性试验数据表

表3 精密度试验数据表

广东省科技计划项目（编号：2015B070701030）。

郭丽仪（1987-），女，广东广州人，专科，助理工程师。研究方向：食品检验。