HPLC法测定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、绿原酸的含量

付 林 古 锐 泽翁拥忠* 天喜格勒

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137； 3.马尔康绿业生物科技开发有限责任公司，四川 马尔康 624000



HPLC法测定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、绿原酸的含量

付 林1古 锐2泽翁拥忠2*天喜格勒3

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137； 3.马尔康绿业生物科技开发有限责任公司，四川 马尔康 624000

目的: 建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、绿原酸含量的方法，比较3种成分在不同部位以及牛蒡子不同炒制时间的含量。方法:采用Welchrom C18柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；柱温为30℃。结果: 3种成分的进样量分别在4.2844～51.4128μg，0.3254～3.9048μg，0.3072～3.6864μg范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为99.64%，100.81%，97.92%，RSD值均小于1.5%；牛蒡叶和牛蒡根中几乎没有牛蒡子苷和牛蒡子苷元；牛蒡子所有炒制品与生品比较，三者的总含量均下降，炒制时间从10～40min时，牛蒡子苷、绿原酸的含量下降，牛蒡子苷元的含量增加。结论:该方法简便、准确，精密度、重复性良好，可为牛蒡子质量控制提供依据，不同部位、炒制时间结果可以为牛蒡综合开发提供依据。

HPLC；牛蒡子苷；牛蒡子苷元；绿原酸；含量测定

牛蒡子为菊科二年生草本牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果实，由于药用价值较高，全国各地亦有普遍栽培[1]。其可生用或炒用(炒牛蒡子)，用时捣碎，其药性辛、苦、寒，归肺、胃经，具有疏散风热、利咽透疹、解毒消肿的功效，属于发散风热药[2]。现代研究表明，牛蒡子具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等多种药理作用，而其主要含牛蒡子苷、牛蒡子苷元等木脂素类[3]，绿原酸等有机酸类和黄酮类等成分[4]。牛蒡根主要含硫炔类、多炔类、多酚类、挥发油、菊糖以及氨基酸等化学成分，具有抗菌、抗突变、防癌、抗氧化、抗疲劳、降血糖、降血脂和免疫调节等药理作用[5]。牛蒡叶主要含黄酮类、多糖、多酚类化合物，具有一定的抗氧化、抑菌作用[6]。此外，牛蒡还是藏药—齐嵩的来源，被各地藏医所用，而《晶珠本草》记载，齐嵩有破痞块，除结石，舒脉之效[7]。研究采用HPLC法测定牛蒡中有效成分牛蒡子苷、牛蒡子苷元、绿原酸的含量，并比较3种成分在牛蒡不同部位以及牛蒡子不同炒制时间的含量，为牛蒡的质量控制和综合开发提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-2010A岛津高效液相色谱仪；SB-52000超声波清洗器(宁波新艺超声设备有限公司)；DZKW-S-4电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；ULUP-1-10T型超纯水机(成都优普超纯水科技有限公司)。1.2 材料 牛蒡子苷对照品(批号：PS11111001，成都普思生物科技股份有限公司，含量>98.5%)；牛蒡子苷元对照品(批号：MUST-15093011，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：99.62%)；绿原酸对照品(批号：PS11111001，成都普思生物科技股份有限公司，含量>98.5%)；甲醇(色谱纯)，甲醇(分析纯)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 称取绿原酸对照品0.01536g、牛蒡子苷对照品0.21422g、牛蒡子苷元对照品0.01627g，共同置于50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，制备成混合对照品储备液。则绿原酸的浓度为0.3072mg/mL，牛蒡子苷的浓度为4.2844mg/mL，牛蒡子苷元的浓度为0.3254mg/mL。

2.2 供试品溶液的制备 取牛蒡子粉末(过60目筛)约0.5g，精密称定，置50mL容量瓶中，加甲醇约45mL，超声提取30min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 色谱柱：Welchrom C18柱(5μm，4.6mm×250mm，柱号 W1021170)；流动相为甲醇-0.1%磷酸水(梯度洗脱：0～3min，30%甲醇；3～10min，30%～50%甲醇；10～30min，50%～65%甲醇)；流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；柱温为30℃；进样体积为10μL。

2.4 系统适用性试验 按照上述色谱条件进行分析，各对照品峰理论塔板数均大于5000，相邻两峰的分离度R大于1.5，系统适用性良好，各组分的色谱峰分离良好，色谱图见图1。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下混合对照品储备液1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0μL，按照“2.3”项下的色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品的进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。表明3种成分在线性范围内，具有良好的线性关系；强制过原点后，r值均能达到0.9999，可采用外表一点法计算该3种成分的含量。

表1 3种成分的线性关系

2.5.2 稳定性试验 取“2.1”项下混合对照品储备液，分别在0、2、6、8、24h时按照“2.3”项下色谱条件进样分析，记录3种成分各自的峰面积，计算得到绿原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3种成分峰面积的RSD分别为0.85%，0.34%，0.97%，表明混合对照品储备液在24h内具有较好的稳定性。

2.5.3 精密度试验 精密量取“2.1”项下混合对照品储备液5μL，按照“2.3”项下的色谱条件重复进样6次，记录各自峰面积，并根据实验数据计算相应的RSD值，得到绿原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3种成分峰面积的RSD分别为1.19%、0.25%、1.46%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批次的牛蒡子粉末(过60目筛)各0.5g，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件,分别进样分析，记录实验数据，计算得到绿原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3种成分含量的RSD分别为0.76%、1.10%、0.69%。结果表明该试验方法重复性良好。

2.5.5 耐用性试验 取制备的同1份供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、24h时，按照“2.3”项下色谱条件，依次进样分析，记录3种成分各自的峰面积，计算得到绿原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3种成分峰面积的RSD分别为1.49%、1.36%、1.43%，结果表明该供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验 取已知含量的牛蒡子粉末(绿原酸为0.616%，牛蒡子苷为11.000%，牛蒡子苷元为0.887%，过60目筛)6份，每份约0.2g，精密称定。并精密加入“2.1”项下混合对照品储备液，使其与样品中各成分含量相同或相近。按“2.2”项下方法制备加样溶液，按照“2.3”项下色谱条件，分别进样分析，结果见表2～4。表明该试验方法准确度良好。

表2 绿原酸加样回收率

表3 牛蒡子苷加样回收率

表4 牛蒡子苷元加样回收率

2.6 含量测定 取13批不同来源的牛蒡子、叶、根样品，打粉，过60目筛；另从批号为“马尔康”牛蒡子样品中取出部分，将其分为4份，进行炒制，炒制时间分别为10、20、30、40min，打粉，过60目筛。合计样品批数为17批。分别从每1份粉末中称取约0.5g，按“2.2”项下方法制得相应供试品溶液,并按照“2.3”项下色谱条件进行含量测定,各成分含量见表5。

表5 牛蒡中3种成分含量测定结果 (n=2，%)

续表5

表5 牛蒡中3种成分含量测定结果 (n=2，%)

3 讨论

本实验前期对提取方法、提取溶剂种类和浓度、提取时间等因素进行了考察。比较了超声30min，超声60min，回流30min3种方法，结果表明，超声30min时牛蒡子中3种成分总含量最高，而回流提取操作不便，结果偏差较大；比较了50%甲醇、甲醇、50%乙醇、无水乙醇4种提取溶剂。结果表明，用甲醇提取时，3种成分总含量最高；比较了超声10、20、30、40、60min5个提取时间，结果表明，超声30min时，3种成分总含量最高。因此，本实验以甲醇为提取溶剂，超声30min为提取方法。

流动相的选择最初建立在文献[8]的基础上，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，结果发现峰型不好且分离不完全，因此改为甲醇-0.1%磷酸水，调整出“2.3”项下的梯度。用PDA检测器在200～400nm波长进行检测，结果发现绿原酸在326nm处有最大吸收，牛蒡子苷在277nm处有最大吸收，牛蒡子苷元在280nm处有最大吸收，综合考虑故测定波长选定为280nm。

含量测定结果显示，不同来源的牛蒡子，其3种成分独自的含量以及总含量都相差较大，出于对牛蒡子有炒用和生用两种用法的考虑，本文对“马尔康”批次牛蒡子样品炒制不同时间后测定含量。结果表明，所有炒制品与其生品比较，三者的总含量均下降；炒制时间从10～40min时，牛蒡子苷、绿原酸的含量有下降的趋势，牛蒡子苷元的含量有增加的趋势。可见，炒制时间对牛蒡子中此3种成分的含量有一定的影响。从结构上来看，绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚3个不稳定部分，因此不能经受高温、强光及长时间加热[9]。牛蒡子苷是苷元和糖结合的结构，水溶性较大，易被酶或酸水解，分子中又含内酯环，可能存在热不稳定性。这种结果提示，不同来源的牛蒡子可能存在不同程度的受热影响。此外，牛蒡叶和牛蒡根中几乎没有牛蒡子苷和牛蒡子苷元，这与前期的文献[10]研究大致相符。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志(第七十八卷)[M]. 北京: 科学出版社，1987: 58.

[2]张廷模. 临床中药学[M].2版.上海: 上海科学技术出版社，2012: 77-78.[3]李卓恒,于彩平,管海燕,等. 牛蒡子化学成分的分离与鉴定[J]. 中国药房,2012,23(39):3696-3699.[4]赵英,周凯,张静,等. HPLC法测定牛蒡子中绿原酸的含量[J]. 中国民族医药杂志,2012,18(9):44-46.

[5]陈世雄,陈靠山. 牛蒡根化学成分及活性研究进展[J]. 食品与药品,2010,12(4):281-285.

[6]娄在祥,王洪新,吕文平,等. 微波辅助提取牛蒡叶多酚及其抗氧化、抗菌活性研究[J]. 食品与发酵工业,2010,36(1):161-165.

[7]杨永昌. 藏药志[M]．西宁: 青海人民出版社，1991: 226-227.

[8]鞠玫君,窦德强,康廷国. 牛蒡子提取物中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量测定研究[J]. 中国现代中药,2008,10(2):14-16.[9]王辉，田呈瑞，马守磊，等.绿原酸的研究进展[J].食品工业科技，2009,30(5):341-345.

[10]袁媛，窦德强，康廷国.高效液相色谱法测定牛蒡药材不同部位牛蒡子苷和苷元的含量[J].中华中医药学刊，2008，26(10):2160-2161.

Simultaneous Determinate the Content of Arctiin，Arctigenin and Chlorogenic acid in Arctium lappa L．by HPLC

FU Lin1GU Rui2ZEWENG Yongzhong2*TIANXI Gele3

1.College of Pharmacy, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137，China; 2.College of Ethnic Medicine, Chengdu University of TCM, Chengdu 611137，China; 3.Ma’erkang L ye Biotechnology Development Limited Liability Company, Ma’erkang 624000,China

Objective To establish a HPLC method for the content determination of Arctiin , Arctigenin and Chlorogenic acid in Arctium lappa L．and to make a comparison of content of this three components among different parts as well different time that ArctiiFructus fried. Methods The separation was carried on Welchrom C18(5μm , 4.6mm×250mm)column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric(gradient elution) at the flow rate of 1.0mL·min-1．The detection wavelength was set at 280nm．The column temperature was 30℃．Results The linear range were 4.2844～51.4128μg for Arctiin, 0.3254～3.9048μg for Arctigenin and 0.3072～3.6864μg for Chlorogenic acid． Average recovery rates were 99.64%，100.81%，97.92%, withRSDless than 1.5%． There was little Arctiin and Arctigenin both in Arctium lappa leaves and Arctium lappa root．Compared with ArctiiFructus that wasn’t fried, total content of three components in fried ArctiiFructus decreased. Content of Arctiin and Chlorogenic acid decreased while Arctigenin increased when frying time changed from 10 minutes to 40 minutes．Conclusion The HPLC method is accurate, reliable and reproducible to analyze three components in Arctium lappa L , which can provide the scientific basis for formulating the quality standard of ArctiiFructus．Results of different parts as well different time that ArctiiFructus fried can provide the scientific basis for comprehensive development of Arctium lappa L.

HPLC; Arctiin ; Arctigenin ; Chlorogenicacid ; Content determination

四川省科技支撑计划(No：2015FZ0032)。

付林(1992-),女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为中药品种、质量与资源开发。E-mail：1069902727@qq.com

泽翁拥忠(1982-)，男，藏族，硕士，讲师，研究方向为民族医学。E-mail：2549626645@qq.com

R932

A

1007-8517(2017)11-0039-04

2017-04-05 编辑：梁志庆)