白藜芦醇对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤保护作用研究*

高原，王越，赵莹莹，王曦，李凡，咸玥桐

（哈尔滨商业大学药学院细胞与分子生物学研究所，黑龙江哈尔滨150076）

白藜芦醇对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤保护作用研究*

高原*，王越，赵莹莹，王曦，李凡，咸玥桐

（哈尔滨商业大学药学院细胞与分子生物学研究所，黑龙江哈尔滨150076）

本文探讨了白藜芦醇对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用，以200μmol·L-1的H2O2制备HepG2细胞氧化应激损伤模型，检测在不同浓度的白藜芦醇（0、5、10、20、40μg·mL-1）的保护作用下，对细胞丙二醛（MDA）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响。结果表明，白藜芦醇作用于HepG2细胞后，能够降低H2O2诱导损伤引起的丙二醛（MDA）升高，提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，表明白藜芦醇对H2O2诱导所致肝细胞氧化损伤具有一定的保护作用。

白藜芦醇；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；丙二醛

白藜芦醇（resveratrol）是一种广泛存在于自然界多种植物中的多酚类化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎、预防癌症、调节免疫功能等多种药理活性，被广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等领域[1]。氧化还原反应存在于机体的整个生命过程中，正常情况下处于一种动态平衡状态，一旦体内的氧化物大量产生积累或抗氧化系统功能减弱，都会导致组织细胞的氧化损伤[2]，并引发多种疾病。有研究表明，白藜芦醇对酒精、H2O2、四氯化碳等所致的肝损伤具有一定的保护作用[3]。HepG2细胞来源于人类肝胚细胞瘤，所含生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞具有同源性，它保留了较完整的生物转化代谢Ⅰ相和Ⅱ相酶，是检测肝功能损伤的理想细胞系[4]。本研究拟通过构建HepG2细胞氧化损伤模型，观察白藜芦醇对HepG2细胞氧化损伤的保护作用，为探讨其抗氧化损伤机理奠定理论基础。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

HepG2细胞（哈尔滨商业大学细胞与分子生物学研究所保存）；四甲基氮唑盐（Sigma公司）；白藜芦醇标准品≥98%（上海伊卡生物技术有限公司）；RPMI1640培养基（四季青）；胎牛血清（四季青）；MDA、SOD和GSH-Px试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 仪器与设备

BSA223S-CW型分析天平（上海精天电子仪器公司）；HH-ZK型二孔多能水浴锅（郑州英裕予华仪器有限公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；酶标仪ELx800（BioTek）；CO2培养箱（memmert），生物安全柜（Airstream）。

1.3 方法

1.3.1 细胞的培养及传代将在液氮中冻存的细胞株从液氮罐中取出，迅速置于37℃的水浴中，反复摇动，将冻存管中物质全部溶解，置于生物安全柜中。首先，使用75%乙醇将冻存管的管口擦净，小心开盖，并用微量移液器吸净管中液体，转移至15mL离心管中，补充10mL的细胞培养液，1500r·min-1离心5min，弃上清。将10%胎牛血清的细胞培养液加入离心管中，混匀后转移至细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2孵化培养箱中培养过夜，次日更换培养液后继续培养。

1.3.2 MTT法检测白藜芦醇对HepG2细胞存活率的影响取处于对数生长期的HepG2细胞，使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释成1×104个细胞·mL-1；将200μL细胞悬液分别加入96孔板每个孔中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。每孔中加入设定浓度的白藜芦醇，稀释至需要的工作浓度（0、5、10、20、40、80μg·mL-1）。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养72h。MTT用无血清RPMI1640培养液配成浓度为5mg·mL-1的溶液，每孔中加入20μL，置于37℃5%CO2孵化培养箱中孵育4h。吸出上清，用培养液洗涤3次后加入100μL DMSO溶解沉淀物，用漩涡振荡器混匀并在OD570nm下进行检测[5]。按下列公式计算药物对HepG2细胞的存活率：

细胞生长存活率＝（实验组OD/对照组OD）×100%

1.3.3 白藜芦醇对H2O2诱导肝细胞抗氧化酶活力等指标的影响取处于对数生长期的HepG2细胞接种于6孔培养板，每孔1×104细胞，培养约12h后，分为阴性对照组、阳性对照组和不同浓度的白藜芦醇组。阴性对照组不加受试物；阳性对照组只加入200μmol·L-1H2O2干预6h，白藜芦醇组分别加入浓度为（0、1、5、10、20、40μg·mL-1）预处理12h，各浓度再加入200μmol·L-1H2O2作用6h，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。干预结束后用0.01mol·L-1PBS清洗2次，然后每孔加入1%Triton100的PBS缓冲液0.5mL，细胞裂解液裂解细胞后2000r·min-110min离心取得上清，参照试剂盒要求，测定细胞中MDA水平、SOD活性、GSH-PX活性等相关氧化损伤的指标。

1.3.4 统计学处理及方法应用SPSS统计软件包进行数据统计学处理。采用ANOVA方差分析并行方差齐性检验；结果以X±S表示。

2 结果与讨论

2.1 MTT法测定白藜芦醇对HepG2细胞的抑制作用

本文选择HepG2细胞进行MTT实验测定白藜芦醇对其抑制情况。与空白对照组相比白藜芦醇浓度（0、5、10、20、40、80μg·mL-1）保护组表现为低浓度时对细胞无明显抑制作用和高浓度时具有一定的抑制作用。如图1所示，在0～40μg·mL-1白藜芦醇对HepG2细胞的抑制率≤3%，说明在0～40μg·mL-1浓度下对HepG2细胞无明显抑制作用，故下一步实验白藜芦醇保护组选择0～40μg·mL-1的浓度范围。

图1白藜芦醇对HepG2细胞的抑制率的测定（p＜0.05）Fig.1Inhibition rate determination of resveratrol on HepG2 cells（p＜0.05）

2.2 白藜芦醇对H2O2诱导HepG2细胞抗氧化酶活力的影响

与空白对照组比较，H2O2诱导模型组细胞悬液中SOD活性明显降低,GSH-Px活性明显下降，MDA水平明显升高。白藜芦醇在0～40μg·mL-1浓度范围对HepG2细胞的保护作用下，肝细胞悬液中SOD活性升高，GSH-Px活性升高，MDA水平明显上升，且变化趋势均呈明显的剂量依赖性，见图2～4。

图2白藜芦醇对HepG2细胞SOD活性的影响（p＜0.05）Fig.2Effect of resveratrol on HepG2 cells SOD activity（p＜0.05）

图3白藜芦醇对HepG2细胞MDA水平的影响（p＜0.05）Fig.3Effect of resveratrol on HepG2 cells MDA level（p＜0.05）

图4白藜芦醇对HepG2细胞GSH-Px活性的影响（p＜0.05）Fig.4Effect of resveratrol on HepG2 cells GSH-Px activity（p＜0.05）

3 结论

当生物体内正常的氧化还原反应动态平衡被打破时，往往会导致组织细胞的氧化损伤。丙二醛（MDA）是肝细胞脂质过氧化反应的终产物，MDA的测定可以用于评价氧自由基介导的细胞损伤。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，其活力反应机体清除氧自由基的能力[6]。GSH-Px能够有效的清除脂质和其他的有机的氢过氧化物，是氧化应激中发挥保护作用的重要酶[7]。

本实验结果表明，适当浓度的白藜芦醇能抑制H2O2所诱导的细胞氧化应激损伤，白藜芦醇对H2O2所致的肝细胞损伤有明显的抗氧化作用,能够提高HepG2细胞的SOD和GSH-Px的活性，降低MDA含量，表明白藜芦醇对肝细胞具有一定的保护作用。

［1］周玲芝.白藜芦醇酒剂对老龄小鼠MDA、SOD和GSH-PX的影响［J］.湖南中医药大学学报,2010,30（7）:45-46.

［2］卞梦瑶,方勇,裴斐,等.生姜油树脂对过氧化氢引起的RAW264. 7巨噬细胞损伤的保护作用［J］.食品科学,2014,35（1）:244-249.

［3］周晓云,崔晓明,崔国金,等.白藜芦醇对小鼠酒精性肝损伤的抑制作用［J］.河北联合大学学报,2014,16（1）:3-5.

［4］王玉娇.草苁蓉多糖对肝细胞氧化损伤的保护作用［D］.延边大学,2014.

［5］黄娜娜.柑橘精油抗氧化特性及对皮肤细胞氧化损伤的保护作用研究［D］.华中农业大学,2016.

［6］赵旭,刘寿荣,冯仙菊,等.从氧化应激谈白藜芦醇对高尿酸介导的非酒精性脂肪肝大鼠的影响［J］.中华中医药学刊,2016,34（5）:1193-1195.

［7］徐俊吉,吕士杰,魏景艳,等.含硒抗体模拟谷胱甘肽过氧化物酶的研究进展［J］.吉林医药学院学报,2010,31（4）:220-223.

Oxidation damage protection research of resveratrol on HepG2 cells induced by H2O2*

GAO Yuan*,WANG Yue,ZHAO Ying-ying,WANG Xi,LI Fan,XIAN Yue-tong
（College of Pharmacy,Cell and Molecular Biology Research Institute,Harbin Commercial University,Harbin 150076，China）

In this paper,the oxidation damage protection of resveratrol on HepG2 cells induced by H2O2was studied.HepG2 cells oxidative stress damage model was built by 200μmol·L-1H2O2.Under different concentration of resveratrol（0,5,10,20 and 40μg·mL-1）,the cells of malondialdehyde（MDA）content,superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）activity were determined.The results demonstrated that the effect of resveratrol on HepG2 cells can reduce MDA content increased by H2O2induced damage,and increase the SOD and GSH-Px activities.It suggests that resveratrol has certain protective effects on liver cells oxidative damage induced by H2O2.

resveratrol；superoxide dismutase（SOD）；glutathione peroxidase（GSH-Px）；malondialdehyde（MDA）

TS262

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170616

2017-03-14

哈尔滨商业大学大学生创新创业训练计划国家级项目（2016 10240004）资助

高原（1983-），女，讲师，2012年毕业于东北林业大学植物学专业，博士，研究方向：抗氧化活性作用机制。