CD109、DPC4/Smad4在食管鳞状细胞癌中的表达及其相关性

宋文庆， 俞 岚， 周 蕾， 王丹娜， 吴 强

1蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠 2330302安徽医科大学病理学教研室，合肥 230022

CD109、DPC4/Smad4在食管鳞状细胞癌中的表达及其相关性

宋文庆1， 俞 岚1， 周 蕾1， 王丹娜1， 吴 强2△

1蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，蚌埠 2330302安徽医科大学病理学教研室，合肥 230022

目的 探讨CD109和DPC4/Smad4的表达与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)发生发展的关系，以及二者的相关性。方法 采用免疫组化ElvisionTMplus法检测正常食管黏膜组织、食管鳞状上皮非典型增生(包括轻、中、重度)、食管鳞状细胞原位癌以及ESCC(包括高分化、中分化和低分化)中CD109和DPC4/Smad4的表达情况。结果 ①CD109在ESCC中的阳性表达率高于在食管正常黏膜、非典型增生和原位癌，差异有统计学意义(P<0.05)；而DPC4/Smad4在ESCC中的阳性表达率低于在食管正常黏膜、非典型增生和原位癌，差异有统计学意义(P<0.05)。②在轻、中、重度非典型增生和原位癌中，CD109的表达阳性率逐渐增加，组间差异有统计学意义(均P<0.05)；而DPC4/Smad4的表达逐渐下降，组间差异有统计学意义(P<0.05)。③随ESCC分化程度的降低，CD109表达增加，而DPC4/Smad4表达下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；④ESCC中CD109与DPC4/Smad4的表达呈负相关(rs=-0.354，P<0.05)。结论 CD109和DPC4/Smad4与食管鳞状细胞癌的发生发展密切相关，二者在ESCC的发生发展中呈负相关。

CD109； DPC4/Smad4； 食管鳞状细胞癌

食管鳞状细胞癌是目前发生率和病死率较高的恶性肿瘤之一，其发生有一个从鳞状细胞轻度非典型增生到原位癌再发展为浸润性癌的渐进过程，探讨此过程的变化机制对于食管鳞状细胞癌的治疗和预后评估具有十分重要的意义。CD109是一种细胞表面抗原，为糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol，GPI)联结的糖蛋白，属于含硫酯的α2巨球蛋白/补体C3、C4、C5超家族成员[1-2]，同时也是TGF-β/Smads信号通路中新的辅助受体[3]。而DPC4/Smad4是TGF-β信号通路中非常重要的调节蛋白，为所有TGF-β超家族信号转入细胞核所必须。本研究通过联合检测CD109、DPC4/Smad4在正常食管黏膜(normal esophageal mucosa)、非典型增生(atypical hyperplasia of esophageal squamous cell)、原位癌(the carcinoma in situ of esophageal squamous cell)和不同分化程度的浸润性鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表达情况，探讨食管鳞状细胞癌的发生、发展机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机选取蚌埠医学院第一附属医院病理科2013年6月～2014年6月存档蜡块，其中食管切缘组织作为正常黏膜组织20例，食管鳞状上皮非典型增生18例(其中轻～中度8例，重度10例)，食管鳞状上皮原位癌17例，食管浸润性鳞状细胞癌50例，所有标本均经病理证实。其中50例浸润性鳞状细胞癌中高分化15例，中分化25例，低分化10例。所有病例术前均未行放、化疗。

1.2 主要试剂及材料

羊抗人CD109多克隆抗体购自美国R&D公司；鼠抗人DPC4/Smad4单克隆抗体购自Santa Cruz公司；显色剂DAB购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 免疫组织化学ElvisionTMplus法

将石蜡标本4 μm厚连续切片并烤干，于二甲苯溶液及不同浓度梯度的乙醇中脱蜡至水。免疫组织化学染色操作步骤按试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照。依次苏木精复染细胞核、盐酸乙醇分化、返蓝、脱水透明，中性树胶封片。

1.4 结果判断

CD109、DPC4/Smad4均以细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。采用染色强度和阳性细胞比例相结合的二次计分法。每例标本随机计数10个高倍视野(×400)，首先根据染色强度计分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。再根据每个高倍视野中阳性细胞百分比计分，阴性为0分，阳性细胞<10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将染色强度得分和阳性细胞百分比得分的乘积作为判断标准，积分≤1为阴性，>1为阳性。免疫组化结果由2位病理医师采用独立双盲法判定。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。CD109和DPC4/Smad4在正常食管黏膜、非典型增生、原位癌和浸润性鳞状细胞癌各组中表达的差异比较采用卡方检验，相关分析采用Spearman等级相关检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD109和DPC4/Smad4在不同食管组织中的表达

免疫组化标记结果显示，CD109在食管正常黏膜中的阳性表达率为45.0%(9/20)、非典型增生和原位癌中表达率为68.6%(24/35)，浸润性癌中为82.0%(41/50)，3组差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。DPC4/Smad4在食管正常黏膜中的阳性表达率为60.0%(18/20)、非典型增生和原位癌中表达率为42.9%(15/35)，浸润性癌中为26.0%(13/50)，3组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1、图2。

表1 CD109、DPC4/Smad4在正常食管黏膜、非典型增生和原位癌、浸润性鳞状细胞癌中的表达

图1 CD109蛋白在正常食管黏膜(A)、非典型增生(B)及ESCC(C)中的表达(ElvisionTM plus法，×400)Fig.1 Expression of CD109 protein in normal esophageal mucosa(A)，esophageal mucosa dysplasia(B)and ESCC(C)(ElivisionTM plus，original magnification，×400)

图2 DPC4/Smad4蛋白在正常食管黏膜(A)、非典型增生(B)及ESCC(C)中的表达(ElvisionTM plus法，×400)Fig.2 Expression of DPC4/Smad4 protein in normal esophageal mucosa(A)，esophageal mucosa dysplasia(B)and ESCC(C)(ElivisionTM plus，original magnification：×400)

2.2 CD109、DPC4/Smad4在食管黏膜不同级别非典型增生和原位癌中的表达

CD109在轻～中度非典型增生中的表达阳性率为75.0%(2/8)，在重度非典型增生和原位癌中的表达阳性率为77.8%(21/27)，组间差异有统计学意义(P<0.05)。DPC4/Smad4在轻～中度非典型增生中的表达阳性率为75.0%(6/8)，在重度非典型增生到原位癌中的表达阳性率为33.3%(9/27)，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1、2。

表2 CD109、DPC4/Smad4在食管黏膜不同级别非典型增生和原位癌中的表达情况(例)

2.3 CD109、DPC4/Smad4在不同分化程度食管浸润性鳞状细胞癌中的表达

CD109在高分化食管浸润性鳞状细胞癌中的表达阳性率为40.0%(6/15)，在中分化浸润性鳞状细胞癌中的表达阳性率为60.0%(15/25)，在低分化癌中的表达阳性率为90.0%(9/10)，组间差异有统计学意义(P<0.05)。DPC4/Smad4在高分化浸润性鳞状细胞癌中的表达阳性率为53.3%(8/15)，在中分化癌中的表达阳性率为16.0%(4/25)，在低分化癌中的表达阳性率为10.0%(1/10)，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 CD109与DPC4/Smad4在食管浸润性鳞状细胞癌中表达的相关性

在食管浸润性鳞状细胞癌中CD109与DPC4/Smad4均阴性者11例，CD109阳性而DPC4/Smad4阴性表达28例，CD109阴性而DPC4/Smad4阳性表达26例，CD109和DPC4/Smad4均阳性表达4例，Spearman等级相关分析显示，随着CD109的表达增高，DPC4/Smad4的表达降低。二者呈负相关(rs=-0.354，P<0.05)。

表3 CD109、DPC4/Smad4在不同分化程度食管浸润性鳞状细胞癌中的表达(例)

3 讨论

DPC4是首先发现于胰腺癌中的抑癌基因[4-5]，其蛋白质产物Smad4是转化生长因子β(TGF-β)超家族受体的直接作用底物。作为共同通路型Smads，其与不同的Smad蛋白相互作用是信号转导的中心环节，也是所有TGF-β超家族信号转导入细胞核所必须的。而TGF-β能够调节细胞的增殖、分化和凋亡，同时还具有调节细胞外基质的合成以及免疫调节等作用。因此，DPC4/Smad4的表达情况与细胞的增殖、分化及凋亡有关。随着DPC4/Smad4的表达增强，可以使细胞停滞在G1期，还可以诱导细胞凋亡[6-7]。但是，其表达下调和失活，将导致细胞异常增生活跃和异型增生甚至肿瘤的发生。目前的研究发现在胰腺癌[8]、肺癌[9]等多种肿瘤中均发现有DPC4的失活。本研究结果显示，从食管正常黏膜到不典型增生到原位癌及浸润性癌，DPC4/Smad4的阳性表达率逐渐降低，提示随着DPC4/Smad4表达的下调，其对食管鳞状细胞的增殖抑制作用逐渐降低，细胞增生逐渐活跃并最终导致鳞状细胞癌的发生。DPC4/Smad4与食管鳞状细胞癌的发生发展有关。

CD109最初是作为造血干细胞的标记物之一[10]，是一种细胞表面抗原，也是TGF-β/Smads信号通路中的辅助受体之一。CD109编码的基因位于第6号染色体。通过与TGF-βⅠ、Ⅱ型受体作用间接影响TGF-β信号的级联活性[11]。在配体存在的情况下，CD109通过与TGF-βⅠ型受体结合成复合体，增加TGF-βⅠ型受体的内吞作用并促进受体降解，同时抑制了TGF-β1诱导的Smad 2、3磷酸化。而在TGF-β信号转导途径中Smad 2、3只有被Ⅰ型受体磷酸化之后才能够与Smad4形成复合物，从而将TGF-β信号转运至细胞核内。因此，随着CD109表达的逐步增强，导致了Smad 2、3磷酸化受阻，TGF-β信号转导受阻，阻碍了DPC4/Smad4的表达，造成DPC4基因失活，Smad-TGF-β信号转导途径被破坏，导致肿瘤的发生。目前的研究发现CD109的表达上调与肝癌[12]、胰腺癌[13]等多种肿瘤的发生有关，尤其在肺、口腔、食管、胆囊以及子宫颈的鳞状细胞癌中CD109均呈高表达[14-17]。本研究中CD109的表达从食管正常黏膜到不典型增生、原位癌及浸润性癌，CD109的阳性率逐渐增高，同时，在食管鳞状细胞癌的不同分化级别中，CD109的表达也有差异，随着分化程度的降低CD109表达增高。提示食管鳞状细胞癌的发生发展与CD109表达的增高有关，与文献报道一致。

本研究分析CD109与DPC4/Smad4表达的相关性发现，随着CD109表达的增高DPC4/Smad4的表达下降，二者呈负相关。因此，联合检测CD109与DPC4/Smad4基因的表达对于判断食管鳞状细胞癌的发生发展和预后有一定的意义，同时可为食管鳞状细胞癌的基因靶向治疗提供依据。

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(2016-09-07 收稿)

Expression of CD109，DPC4/Smad4 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma and the Correlation

Song Wenqing，Yu Lan，Zhou Leietal

DepartmentofPathology，TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollge；DepartmentofPathology，BengbuMedicalCollege，Bengbu233030，China

Objective To investigate association of expression of CD109 and DPC4/Smad4 with the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma，and correlation between CD109 and DPC4/Smad4.Methods Immunohistochemical method was used to determine the expression of CD109 and DPC4/Smad4 in normal esophageal mucosa tissues，esophageal squamous epithelial atypical hyperplasia(including mild，medium and severe)，esophageal squamous cell carcinomainsituand invasive squamous cell carcinoma of the esophagus(including high，medium and low differentiation).Results ① The CD109 positive rate in ESCC was significanlty higher than that in normal esophageal mucosa，atypical hyperplasia and carcinomainsitu(P<0.05)；while DPC4/Smad4 in ESCC was significanlty lower than that in normal esophageal mucosa，atypical hyperplasia and carcinomainsitu(P<0.05).The positive rate of CD109 was gradually increased in order of the mild，moderate，severe atypical hyperplasia to carcinomainsitu(P<0.05)；while the positive rate of DPC4/Smad4 was gradually declined，respectively(P<0.05).③ With the decreasing of ESCC differentiation degree，CD109 expression increased，and the expression of DPC4/Smad4 declined，the difference was statistically significant(P<0.05)；④ In ESCC，CD109 was negatively correlated with the expression of DPC4/Smad4(rs=-0.354，P<0.05).Conclusion CD109 and DPC4/Smad4 are closely related to the development of ESCC，and in ESCC，CD109 is negatively correlated with the expression of DPC4/Smad4.

CD109； DPC4/Smad4； esophageal squamous cell carcinoma

R735.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.012

宋文庆，女，1971年生，医学硕士，讲师，E-mail：1043910994@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：1043910994@qq.com