猪Nramp1基因内含子6多态性与仔猪腹泻的相关性

古少波，杜 倩，舒 丹，李志瑕，田晓静，刘丽霞

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州730030)

猪Nramp1基因内含子6多态性与仔猪腹泻的相关性

古少波，杜 倩，舒 丹，李志瑕，田晓静，刘丽霞*

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州730030)

为了研究猪Nramp1基因内含子6的多态性与仔猪腹泻的相关性，采用PCR-RFLP法对八眉猪和烟台黑猪Nramp1基因内含子6的多态性进行研究。结果表明：两个猪种在该基因内含子6的多态性较低，共检测到两个等位基因(A、B)和两种基因型(AB、BB)，八眉猪多态信息含量(PIC)为0.33，烟台黑猪为0.36。卡方适合性检验显示，两猪种的Nramp1 基因内含子6极显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。相关性分析结果表明，八眉猪对腹泻的抵抗能力显著高于烟台黑猪(P<0.05)。性别与Nramp1基因内含子6基因型对仔猪腹泻影响不显著(P>0.05)，而性别与基因型的互作对仔猪腹泻有显著影响(P<0.05)，在母猪群体中，AB基因型的腹泻评分极显著大于BB基因型(P<0.01)；在公猪群体中，AB和BB基因型腹泻评分差异不显著(P>0.05)。

八眉猪；烟台黑猪；Nramp1基因；腹泻；多态性

长期以来，人们对畜禽类动物的选育多出于经济方面的考虑。随着人类需求的不断提高，养殖规模不断扩大，各种抗生素等药物的滥用，导致病原微生物的抗药性不断增强，使得疫病防控问题变得更加严峻，在基因水平上对动物进行抗病基因选育的重要性也日渐凸显。仔猪腹泻给养猪产业带来了巨大的损失。疾病的发生主要取决于自然环境和群体免疫水平，当前亟待解决的难题是筛选抗病基因型并培育出抗病能力强的品种。天然抗性相关巨噬蛋白1(natural resistance associated marophage protein 1，Nramp1)基因作为抗病育种的候选基因在抗病方面存在极大的应用价值。Nramp1基因是一个比较保守的基因，影响动物的自身免疫，与沙门氏菌及多种胞内寄生病原菌的抵抗作用有关，对疾病的抗性具有非病原特异性[1]。近年来，随着分子生物学及分子遗传学研究的日益深入，技术日益成熟，在基因水平研究猪Nramp1基因的多态性有助于通过分子遗传的方法对其进行抗病育种。

Belouchi等[2]最初在小鼠(musmusculus)身上发现Nramp基因，随后将该类基因命名为Nramp基因家族，Nramp1基因作为该基因家族的成员能够编码具有完整膜的磷酸糖蛋白，含有10～12个推定的转膜区域，具有离子通道和转运功能特征，是一个较为保守的基因[3]，主要存在于血液外周白细胞以及脾脏、肺等具有网状内皮细胞的器官，与多种病原微生物的抗性有关，其作用机理是通过转运细菌自身合成防御酶系所必需的金属离子如Mn2+或 Fe2+等，使病原微生物无法合成防御酶系，从而使动物免受细菌等病原体的侵染[4]。研究表明，人、鼠、猪的Nramp1基因均包括15个外显子和14个内含子，人Nramp1基因全长为13 604 bp，小鼠与猪的分别为12 kb和15 kb左右[5-7]。猪的Nramp1基因被定位于第15号染色体的q23-26[8]。Nramp1基因特异表达于外周血细胞和吞噬细胞中，可以作为猪等畜禽动物综合抗病能力筛选的良好候选基因[9]。

目前国内外学者关于Nramp1基因做了大量研究工作，Liu 等[10]通过对鸡的SNP分析发现，保守区的 SNP 与肠炎沙门氏菌疫苗接种及病原攻击后的免疫应答相关。Paixao等[11]通过 SSCA 法分析荷斯坦牛和瘤牛Nramp1基因 3′UTR 区的遗传变异，发现不同品种间基因频率差异显著，且不同基因型对布鲁氏菌的抗性和敏感性差异显著。罗文华[7]研究发现猪Nramp1基因的第6内含子存在多态位点。吴宏梅等[9]在大白猪和松辽黑猪中证实了该多态位点，并发现该多态位点与猪中性粒细胞还原力和单核细胞的细胞毒作用百分率间呈显著相关，认为Nramp1基因可作为猪抗病力筛选的一个主要候选基因。杨军等[12]对猪的Nramp1基因第6内含子进行多态性研究，发现群体中该位点杂合度较高、纯合度较低，具有中度遗传多态性。Fattahi-Dolatab等[13]通过对人Nramp1基因D543N多态性研究发现，患皮肤利什曼病患者与健康个体的基因型存在极显著差异。Liu等[14]通过PCR-RFLP方法研究Nramp1基因多态性与荷斯坦牛肺结核病的相关性，建立了两个遗传标记，认为该基因是研究其多态性与结核病相关的良好的候选基因。Hedges等[15]通过研究Nramp1基因提高小鼠对贝纳特氏立克次体(Coxiellaburnetii)的抵抗能力发现该基因产生的蛋白在先天免疫保护中具有重要作用。由此可见，探索Nramp1基因多态性与疾病之间的关联性具有一定的理论价值和实际意义。

本研究利用PCR-RFLP法，对八眉猪和烟台黑猪Nramp1基因内含子6进行多态性分析，研究该基因与仔猪腹泻的相关性，以期寻找对抗仔猪腹泻的遗传标记，并在分子遗传和育种水平上为选育抗病能力强的品种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究以青海互助县102头八眉猪和兰州市红古区41头烟台黑猪为实验材料，将采集的猪耳组织置于装有75%酒精的EP管中，运回实验室保存于-20 ℃冰箱内。采用苯酚/氯仿抽提法对两猪种基因组DNA进行提取，置-20 ℃冻存备用。采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 的浓度。

仔猪哺乳期间每天早、中、晚观察排便情况，分别检查仔猪肛门有无粪便污染及红肿情况，记录，并按照仔猪粪便形状及腹泻判断标准(表1)进行评分[16]。

表1 仔猪腹泻评分标准

Table 1 Scoring criterion of piglet diarrhea

腹泻程度Diarrheadegree粪便形态观察Shapeobservationofthefaeces腹泻指数Diarrheaindex正常Normal条状Strip0轻微Slight成形且较软Formingandsoft1中度Moderate粪水无分离现象,稀便Manurewaterwithoutseparation,loosestools2严重Serious液体,不成形,粪水分离Liquid,deformed,manurewaterseparation3

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

根据文献报道，采用Nramp1基因内含子6部分片段扩增引物进行扩增[9]，上游引物为5′-GCCAGCTTCCACAGTCTCCAG-3′ ；下游引物为5′-GGGGGTACAAAGGGGAAGAAG-3′，由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.2 PCR扩增

PCR扩增体系：DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，2×PowerTaqPCR MasterMix 11.0 μL，加ddH2O至20 μL。

PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循环30次，72 ℃再延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 限制性内切酶酶切体系及电泳检测

酶切反应体系：PCR扩增产物3.0 μL，限制性内切酶NdeⅠ(识别位点序列为CA^TATG)0.2 μL，Cutsmart Buffer 1.0 μL，加ddH2O至10 μL，37 ℃恒温水浴过夜。酶切产物采用 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，酶切产物与 2.5 μL 6×Loading Buffer混合，常温下200 V 预电泳30 min，150 V 电泳4 h。电泳结束，用银染显色法判定基因型，染色过程的水浴温度保持56 ℃。

1.2.4 数据分析

利用PopGene软件计算基因型频率、等位基因频率、纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)，并进行基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验；利用PIC软件计算多态信息含量；通过SPSS17.0软件建立模型进行腹泻相关性分析，统计模型为：

Yijk=μ+Bi+Gj+Sk+eijk。

式中：Yijk为仔猪腹泻评分分值；μ为群体均值；Bi为第i个品种的固定效应；Gj为第j种基因型的固定效应；Sk为第k种性别的固定效应；eijk为随机残差效应。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增Nramp1基因内含子6

采用1%的琼脂糖凝胶检测PCR产物，扩增产物电泳分析结果如图1所示。Nramp1基因内含子6的扩增片段大小在500 bp附近，与预期扩增片段大小相符，条带清晰，无杂带，特异性良好，能够用于PCR-RFLP分析。

2.2Nramp1基因NdeⅠ酶切产物的电泳分析

利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析Nramp1基因内含子6酶切产物(图2)，共检测到2个等位基因A、B和2种基因型AB、BB，其中AB基因型为3个片段(483 bp/373 bp/110 bp)，BB基因型为2个片段(373 bp/110 bp)。

2.3 PCR-RFLP基因型和等位基因频率分布及其多态性分析结果

八眉猪和烟台黑猪Nramp1基因内含子6基因型和等位基因频率见表2。由表2可知，两猪种优势基因型均为AB型，B基因为优势等位基因。χ2检验结果表明，八眉猪和烟台黑猪Nramp1基因在该位点上极显著偏离Hardy-Wein-berg平衡。

1～7，PCR产物；M，DL 2 000 Ladder(Dye Plus)1-7， PCR production; M， DL 2 000 DNA Ladder (Dye Plus)图1 Nramp1基因内含子6 PCR产物检测结果Fig.1 PCR product of Nramp1 intron 6

M， 20 bp DNA ladder；1、2、6、11， BB基因型；3～5和7～10， AB基因型M， 20 bp DNA Ladder; 1， 2， 6 and 11， Genotype BB; 3-5 and 7-10， Genotype AB图2 Nramp1基因内含子6 NdeⅠ酶切结果Fig.2 NdeⅠdigestion results of Nramp1 intron 6

多态信息含量(PIC)用来衡量动物体多态性的指标，其与杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)共同评价群体遗传变异程度，遗传参数的不同表明各群体之间的遗传差异性[7]。由表3可知，八眉猪与烟台黑猪杂合度均大于纯合度，有效等位基因数均接近实际等位基因数，两猪种多态信息含量(PIC)较低，分别为0.33和0.36。

2.4Nramp1基因与仔猪腹泻的相关性分析结果

在两猪种Nramp1基因内含子6与仔猪腹泻的相关性分析当中，品种效应对仔猪腹泻有显著影响(P<0.05)，无论是基因型效应还是性别效应对仔猪腹泻的影响均不显著(P>0. 05)，而性别与基因型的交互作用对仔猪腹泻存在显著影响(P<0.05)。

不同猪种的腹泻评分见表4，品种差异与仔猪腹泻存在显著关联性，其中烟台黑猪的腹泻评分明显高于八眉猪(P<0.05)，说明烟台黑猪对腹泻更为敏感。不同性别个体Nramp1基因内含子6的基因型与仔猪腹泻间的相关性分析见表5。结果表明，在母猪群体中AB基因型腹泻评分极显著大于BB基因型(P<0.01)，说明母猪群体中AB基因型为易感基因型。在公猪群体中，AB和BB基因型对腹泻影响不显著(P>0.05)。

表2Nramp1基因内含子6 基因型频率和等位基因频率

Table 2 Genotype and allele frequency ofNramp1 intron 6

品种Varieties基因型频率GenotypefrequencyABBB等位基因频率AllelicfrequencyABχ2值χ2value八眉猪Bameipig0.60(61)0.40(41)0.300.7018.21**烟台黑猪Yantaiblackpig0.73(30)0.27(11)0.370.6313.12**

**表示差异极显著P<0.01。括号中的数据为所检测的个体数。

**means the very significant difference atP<0.01. The number in brackets is the number of detected individuals.

表3Nramp1 基因内含子6遗传多态性分析

Table 3 Genetic polymorphism analysis ofNramp1 intron 6

猪种Breed纯合度(Ho)杂合度(He)有效等位基因数(Ne)多态信息含量(PIC)八眉猪Bameipig0.400.601.720.33烟台黑猪Yantaiblackpig0.270.731.870.36

表4 品种对仔猪腹泻评分的影响

Table 4 The correlation analysis of cultivated varieties in piglet diarrhea

同列数据后无相同小写字母表示数据间差异显著(P<0.05)。腹泻评分分数以最小二乘均值±标准误表示。

The values without the same small letters in a column indicate the significant difference atP<0.05 level. Diarrhea score values are represented by least square means ± standard errors.

表5 不同性别猪Nramp1基因内含子6的基因型对仔猪腹泻评分的影响

Table 5 Correlation analysis of the genotypes ofNramp1 intron 6 in different gender and piglet diarrhea score

性别Gender基因型Genotype样本数量Samplessize腹泻评分Diarrheascore公猪AB910.76±0.167MaleBB520.83±0.262母猪AB911.15±0.193AFemaleBB520.24±0.280B

相同性别不同基因型之间比较，不同的大写字母表示差异极显著(P<0.01)。无字母表示差异不显著(P>0.05)。腹泻评分分数以最小二乘均值±标准误表示。

Between genotypes in the same gender， the values without the same capital letter indicate the significant difference atP<0.01 level，and the values without letter indicate no significant difference (P>0.05). Diarrhea score values are represented by least square means ± standard errors.

3 讨论

3.1Nramp1基因内含子6遗传多态性分析

动物的抗病性通常是多种不同性状的共同体现，它们受遗传和环境因素的共同影响。Nramp1基因是天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)基因家族的成员，是畜禽类动物抗病育种的重要候选基因，它与牛、鸡等动物的多种疾病存在相关性，研究仔猪腹泻与该基因的相关性存在一定的意义和价值。赵生国等[17]通过对大白、长白等4个猪种的Nramp1基因内含子6进行研究，共检测到3个基因型并发现在该基因第6内含子NdeⅠ酶切位点处各猪种表现出中度多态性。刘艳冬等[18]通过对贵州地方猪种Nramp1基因内含子6研究发现该基因NdeⅠ酶切位点多态性在各猪种中较丰富。本研究利用PCR-RFLP技术，在八眉猪和烟台黑猪143个个体中仅检测到Nramp1基因内含子6的2个等位基因(A和B)和两种基因型(AB和BB)，这说明Nramp1基因内含子6的多态性较低。两猪种均未检测到AA基因型，这可能是由于AA基因型为劣势基因型，在长期的进化选择当中，该基因型个体逐渐被淘汰，这与前人研究大白猪、长白猪等猪种的检测结果一致[7，9，12]。八眉猪和烟台黑猪Nramp1基因内含子6的AB基因型为优势基因型，B基因为优势基因，这与刘艳冬等[18]的研究结果一致。

卡方适合性检验结果显示，两猪种的Nramp1基因内含子6极显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)，这可能是由于在长期的人工选育过程中，所承受的压力较大，从而对Nramp1基因产生一定的影响。He、Ne和PIC常用来衡量群体遗传变异程度，本研究发现，八眉猪和烟台黑猪Nramp1基因具有较高的He，说明这两个猪种的遗传多样性较为丰富，这可能是由于杂合子个体的某些性能高于纯合子个体，使得纯合子个体在长期的自然选择和人工选育过程中逐渐被淘汰，而杂合子个体被较多地保留了下来。而两猪种Ne值均接近实际等位基因数，且PIC值在0.25至0.5之间，进一步说明两猪种Nramp1基因内含子6多态性并不丰富。

3.2 品种、性别和基因型对仔猪腹泻的影响

本研究表明，不同品种间仔猪腹泻差异显著(P<0.05)，八眉猪对腹泻的抵抗能力比烟台黑猪强，这可能是由于青海八眉猪在长期进化和人工选育过程中逐渐适应复杂的自然环境，对疾病有较强的抵抗能力。单独的性别和Nramp1基因内含子6基因型对仔猪腹泻影响均不显著(P>0.05)，但性别与基因型互作对仔猪腹泻存在显著的影响(P<0.05)，在母猪群体中AB基因型的腹泻评分极显著大于BB基因型(P<0.01)，说明母猪群体中AB基因型为易感基因型，而在公猪群体中，AB和BB基因型的腹泻评分差异不显著(P>0.05)，这可能是由于公猪和母猪自身免疫力水平差异所致，也可能是由于长期的自然和人工选择对不同性别仔猪对腹泻的抵抗能力产生了一定影响。

4 结论

本研究表明，八眉猪和烟台黑猪的Nramp1基因内含子6为中度多态，八眉猪对腹泻的抵抗力较强，Nramp1基因内含子6的AB基因型是八眉猪和烟台黑猪的母猪群体对于腹泻的易感基因型。本研究结果可作为对仔猪易感腹泻个体进行认识的遗传标记，并在分子遗传和育种水平上为选育抗病能力强的猪种提供理论参考。

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(责任编辑 卢福庄)

Polymorphism ofNramp1 intron 6 and its correlation with piglet diarrhea

GU Shaobo， DU Qian， SHU Dan， LI Zhixia， TIAN Xiaojing， LIU Lixia*

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestMinzuUniversity,Lanzhou730030，China)

In order to research the polymorphism ofNramp1 intron 6 and its correlation with piglet diarrhea， this study analyzed the polymorphism of theNramp1 intron 6 in Bamei pig and Yantai black pig by PCR-RFLP. The results showed that the polymorphisms ofNramp1 intron 6 were not rich in two pig breeds， two alleles (A， B) and two genotypes (AB， BB) were detected， the polymorphic information content was 0.33 in Bamei pig and 0.36 in Yantai black pig. The Chi square fit test showed that theNramp1 intron 6 deviated from Hardy-Weinberg balance extremely in two pig breeds (P<0.01). The results of the least square showed that， the diarrhea resistance ability of Bamei pig was stronger than that of Yantai black pig (P<0.05). The gender and genotype of theNramp1 intron 6 did not significantly influence piglet diarrhea alone (P>0.05)， but the interaction of the gender and genotype influenced piglet diarrhea significantly (P<0.05) in female piglets， and the diarrhea score of genotype AB was greater than that of genotype BB (P<0.01)， while in male piglets， these two genotypes had not significant difference in diarrhea score (P>0.05).

Bamei pig; Yantai black pig;Nramp1 gene; diarrhea; polymorphism

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.04

2016-12-19

西北民族大学中央学校基本科研业务费专项资金资助项目(31920170029)；西北民族大学本科生科研创新项目(URIP16196)

古少波(1994—)，男，山西朔州人，本科生,研究方向为分子生物学。E-mail：gu.1994@foxmail.com

*通信作者，刘丽霞，E-mail: skllx@xbmu.edu.cn

S828

A

1004-1524(2017)06-0882-06