山银花水提物体外抗甲型H1N1流感病毒的作用研究Δ

陈 灵，周艳萌，欧水平，任 丽（1.遵义医学院附属医院药物临床试验机构，贵州遵义 56000；.遵义医学院微生物学与免疫实验室，贵州遵义 56006；.遵义医学院附属医院药剂科，贵州遵义 56000；.遵义医学院药学院，贵州遵义 56006）

山银花水提物体外抗甲型H1N1流感病毒的作用研究Δ

陈 灵1＊，周艳萌2，欧水平3，任 丽4（1.遵义医学院附属医院药物临床试验机构，贵州遵义 563000；2.遵义医学院微生物学与免疫实验室，贵州遵义 563006；3.遵义医学院附属医院药剂科，贵州遵义 563000；4.遵义医学院药学院，贵州遵义 563006）

目的：考察山银花水提物（SYHW）体外抗甲型H1N1流感病毒（H1N1病毒）的作用。方法：以H1N1病毒感染体外培养的犬肾小管上皮细胞（MDCK细胞），计算病毒的半数组织培养感染剂量（TCID50）；以不同质量浓度SYHW作用MDCK细胞24 h，考察其最大无毒浓度。然后将试验分为正常细胞组、病毒对照组和SYHW预防给药组、治疗给药组和直接杀灭给药组（均给予最大无毒浓度的SYHW，并以100 TCID50H1N1病毒感染细胞），测定SYHW的抗病毒有效率（ER）；将试验分为正常细胞组、病毒对照组和SYHW治疗给药组、直接杀灭给药组（给药及病毒感染方法同上），分别测定细胞增殖指数（PI）和细胞凋亡率的变化。结果：H1N1病毒的100 TCID50为1.26×10－7，SYHW对MDCK细胞的最大无毒浓度为50μg/m L（细胞存活率为91.3%）。SYHW预防给药组、SYHW治疗给药组和SYHW直接杀灭给药组的ER分别为0、80.3%、52.7%。与正常细胞组比较，病毒对照组细胞的PI值显著降低（P＜0.05），早期、晚期凋亡率显著升高（P＜0.05）；与病毒对照组比较，SYHW直接杀灭给药组细胞的PI值显著升高、早期凋亡率显著降低（P＜0.05），SYHW治疗给药组细胞的早期凋亡率显著降低（P＜0.05）。结论：SYHW具有体外抗H1N1病毒的作用，且以治疗给药和直接杀灭给药抗病毒作用较好。

山银花；水提物；MDCK细胞；甲型H1N1流感病毒；体外

流行性感冒（简称“流感”）是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道传染病，以急起高热、全身酸痛、乏力并伴轻度呼吸道症状为临床特点。在各型流感病毒中，宿主范围最广、对人类健康影响最大的是甲型流感病毒[1]。目前，治疗流感的化学药主要有抗病毒药阿昔洛韦、更昔洛韦、利巴韦林（病毒唑）等，这类药通常副作用较多[2]。山银花为灰毡毛忍冬（Loniceraemacranthoides Hand.-Mazz.）、红腺忍冬（LonicerahypoglaucaMiq.）、华南忍冬（LoniceraconfusaDC.）或黄褐毛忍冬（Lonicerae fuluotomentosaHsuetS.C.Cheng）的干燥花蕾或带初开的花[3]，具有抗炎、抗菌[4]、抗病毒、抗氧化[5]、抗动脉粥样硬化[6]等作用，其因清热解毒、凉散风热之功效而被临床广泛应用。有研究表明，山银花中酚酸类成分及绿原酸类提取物具有抗病毒活性[7-9]，咖啡酰奎宁酸类化合物具有抗呼吸道病毒感染作用[10]，黄酮提取物具有体外抗伪狂犬病毒的作用[11]。目前，尚未见山银花体外抗甲型H1N1流感病毒（简称“H1N1病毒”）作用的研究报道，故本研究拟对山银花水提物（简称“SYHW”）的体外抗H1N1病毒的作用进行研究，为其抗病毒应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器

BX43倒置显微镜（日本Olympus公司）；CFM-300E荧光显微镜（上海万衡精密仪器有限公司）；Multiskan-FC酶标仪（美国Thermo公司）；TDZ4-WS低速离心机（上海卢湘离心机仪器有限公司）；Gallios流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.2 药材与试剂

山银花采摘于贵州省绥阳县，经遵义医学院生药学教研室主任杨建文教授鉴定为灰毡毛忍冬（Lonicerae macranthoidesHard.-Mazz.）的干燥花蕾；RPMI1640培养基（上海立菲生物技术有限公司，批号：AAK208935）；胰蛋白酶、MTT、AnnexinⅤ细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：1030E042、1028D051、2015D420）。

1.3 细胞和病毒

犬肾小管上皮细胞（MDCK细胞）、H1N1病毒及9～10日龄鸡胚均由遵义医学院微生物与免疫学教研室提供。

2 方法

2.1 SYHW的制备

称取山银花500g，加10倍量水煎煮1.5h，过滤；滤渣加8倍量水煎煮1h，过滤；合并2次滤液，浓缩至500 mL，得质量浓度为1g/mL（以生药计）的SYHW。

2.2 H1N1病毒的传代增殖

选择9～10日龄健康鸡胚，将0.2mLH1N1病毒液注入尿囊腔内，48h后，收集尿囊液。按照文献[12]中方法，将H1N1病毒液进行倍比稀释，测得其凝血效价为1∶1280。

2.3 H1N1病毒对MDCK细胞的毒性作用测定

将生长旺盛的MDCK细胞消化成单个细胞悬液，按2×104个/孔接种于96孔板中，每孔100μL，在37、5% CO2培养箱中培养24h。待细胞长满单层后，弃上清，然后将凝血效价为1∶1280的病毒液用维持液2（含0.02%胰酶的RPMI1640培养基）倍比稀释10～1010倍后分别加入培养孔中，每个浓度重复10孔，每孔100μL；同时设正常对照组（不加病毒，只加维持液2）。放入培养箱中感染1.5h后，小心吸弃各孔病毒液，换用维持液1（含2%胎牛血清的RPMI1640培养基）继续培养72h。倒置显微镜下观察细胞病变情况，并记录病变程度及孔数，计算被感染细胞比例，根据Karber公式计算病毒的半数组织培养感染剂量（TCID50），以病毒的100TCID50来进行后续研究。

2.4 SYHW对MDCK细胞的毒性作用测定

将生长旺盛的MDCK细胞消化成单个细胞悬液后，按1×104个/孔接种于96孔板中，每孔100μL，置于37、5%CO2培养箱中培养24h。弃上清，加入质量浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL的SYHW，每个质量浓度重复10孔，每孔100 μL；并设置正常细胞组（不加药物）。继续培养24h后，弃上清，每孔加2滴维持液1和10μLMTT溶液，置于37、5%CO2培养箱中继续培养4h。弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡均匀后，在酶标仪上（测定波长为492nm）测定各孔的光密度（OD）值，计算细胞存活率[13]：细胞存活率（%）＝给药组平均OD值/正常细胞组平均OD值×100%，找出SYHW的最大无毒浓度。

2.5 SYHW体外抗H1N1病毒作用测定

将生长旺盛的MDCK细胞消化成单个细胞悬液后，按1×104个/孔接种于96孔板中，于37、5%CO2培养箱中培养24h后，将试验分为正常细胞组、病毒对照组和SYHW的预防给药、治疗给药、直接杀灭给药组，每组均重复6孔，再设1个空白孔。正常细胞组（每个给药组均平行设置）：不用病毒进行感染也不加入药物。病毒对照组（每个给药组均平行设置）：加入100TCID50的H1N1病毒液（100μL/孔），于37、5%CO2培养箱中培养。SYHW预防给药组：先将最大无毒浓度的SYHW加入培养孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培养箱中培养24h后弃去培养液；然后再加入100TCID50的H1N1病毒液（100μL/孔），于37、5%CO2培养箱中感染1.5 h；然后再换为相应质量浓度的SYHW，培养至病毒对照组MDCK细胞出现最大程度病变为止[12-13]。SYHW治疗给药组：先将100TCID50的病毒液加入细胞培养孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培养箱中感染1.5h后弃去病毒液；然后再加入最大无毒浓度SYHW（100μL/孔），继续培养至病毒对照组MDCK细胞出现最大程度病变为止。SYHW直接杀灭给药组：先将最大无毒浓度SYHW与100TCID50H1N1病毒液按1∶1混合后加入培养孔中（100μL/孔），于37、5%CO2培养箱中培养1.5h，弃去混合液；然后加入维持液1继续培养至病毒对照组MDCK细胞出现最大程度病变为止。采用MTT法测定各孔OD值（测定波长为492nm），计算SYHW的抗病毒有效率（ER）[14]：ER（%）＝（给药组平均OD值－病毒对照组平均OD值）（/正常细胞组平均OD值－病毒对照组平均OD值）×100%。

2.6 SYHW对H1N1病毒感染MDCK细胞周期的影响

将生长旺盛的MDCK细胞按1×104个/孔接种于6孔板中，于37、5%CO2培养箱中培养过夜，分别设置正常细胞组、病毒对照组和SYHW的治疗给药、直接杀灭给药组，每个浓度重复3孔，处理方法同“2.5”项。培养结束后收集上清液，用胰酶（未加乙二胺四乙酸）消化细胞。将细胞悬液及上清液混合，离心，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，然后将细胞滴入70%冷乙醇中固定，－20冰箱保存备检。检测前取出样品离心，用冷PBS洗涤3次后，按照1×106个细胞加1m L碘化丙啶（PI）染液，避光染色至少30min，流式细胞仪上机检测。用M cycle软件检测细胞周期分布，计算细胞增殖指数（PI，%）：S期和G2/M期细胞数占细胞总数的百分比。

2.7 SYHW对H 1N1病毒感染MDCK细胞凋亡的影响

将生长旺盛的MDCK细胞按1×104个/孔接种于6孔板中，于37、5%CO2培养箱中培养过夜，按照“2.6”项下分组、给药。结束培养后收集上清液，并用胰酶（未加乙二胺四乙酸）消化细胞，将细胞悬液及上清液混合，离心，PBS洗2次，根据AnnexinⅤ细胞凋亡检测试剂盒操作，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.8 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 H 1N1病毒对MDCK细胞的毒性作用测定结果

H1N1病毒感染MDCK细胞后细胞出现皱缩、变圆、壁增厚、脱落以及折光性增强等细胞病变现象，根据Karber公式计算病毒的TCID50为1.26×10－9，100 TCID50为1.26×10－7。MDCK细胞感染H1N1病毒后细胞形态的变化见图1。

图1 MDCK细胞感染H1N1病毒后细胞形态的变化Fig 1 Cellm orphology changes of MDCK cells after infected by H 1N1 virus

3.2 SYHW对MDCK细胞的毒性作用测定结果

当SYHW质量浓度≥100μg/m L时，SYHW组的OD值与正常细胞组比较差异有统计学意义（P＜0.05），表明当SYHW质量浓度≥100μg/m L时对细胞有明显毒性。故其最大无毒浓度为50μg/m L，此时细胞存活率为91.3%，结果详见表1。

表1 SYHW对MDCK细胞的毒性作用测定结果（n＝10）Tab 1 Determ ination results of toxic effect of SYHW on MDCK cells（n＝10）

3.3 SYHW抗H 1N1病毒作用测定结果

病毒对照组OD值较正常细胞组OD值显著降低（P＜0.05）；SYHW治疗给药后细胞OD值显著升高（P＜0.05），SYHW治疗给药组、直接杀灭给药组ER分别为80.3%、52.7%，SYHW对H1N1病毒感染无预防作用，结果详见表2。

表2 SYHW抗H 1N1病毒作用测定结果（n＝6）Tab 2 Determ ination resultsof anti-H1N1 viruseffect of SYHW（n＝6）

3.4 SYHW对H 1N1病毒感染MDCK细胞周期的影响情况

与正常细胞组比较，病毒对照组细胞PI值显著降低（P＜0.05）；与病毒对照组比较，SYHW直接杀灭给药组细胞PI值显著升高（P＜0.05），结果详见表3。

3.5 SYHW对H 1N1病毒感染MDCK细胞凋亡的影响情况

与正常细胞组比较，病毒对照组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高（P＜0.05）。与病毒对照组比较，SYHW治疗给药组细胞的早期凋亡率显著降低（P＜0.05），然而晚期凋亡率继续升高（P＜0.05）；SYHW直接杀灭给药组细胞的早期凋亡率显著降低（P＜0.05），晚期凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），结果详见表4。

表3 SYHW对H 1N1病毒感染MDCK细胞周期的影响（±s，n＝3）Tab 3 Effects of SYHW on cell cycle of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

表3 SYHW对H 1N1病毒感染MDCK细胞周期的影响（±s，n＝3）Tab 3 Effects of SYHW on cell cycle of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

注：与正常细胞组比较，＊P＜0.05；与病毒对照组比较，#P＜0.05Note：vs.normal cell group，＊P＜0.05；vs.virus control group，#P＜0.05

PI，% 60.85±0.03 39.07±0.03＊45.77±0.03 50.60±0.02#组别正常细胞组病毒对照组SYHW治疗给药组SYHW直接杀灭给药组质量浓度，μg/mL细胞比例，% S 005 0 50 G0/G139.00±3.00 60.95±2.51 54.24±3.07 49.41±1.83 28.44±3.06 30.57±5.38 18.66±6.61 30.23±0.66 G2/M 32.41±3.01 8.50±5.69 27.11±4.52 20.37±1.30

表4 SYHW对H 1N1病毒感染MDCK细胞凋亡的影响（±s，n＝3）Tab 4 Effects of SYHW on apoptosis of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

表4 SYHW对H 1N1病毒感染MDCK细胞凋亡的影响（±s，n＝3）Tab 4 Effects of SYHW on apoptosis of MDCK cells after infected by H1N1 virus（±s，n＝3）

注：与正常细胞组比较，＊P＜0.05；与病毒对照组比较，#P＜0.05Note：vs.normal cell group，＊P＜0.05；vs.virus control group，#P＜0.05

晚期凋亡率，% 0.23±0.15 0.30±0.26＊4.30±0.17#1.90±2.90组别正常细胞组病毒对照组SYHW治疗给药组SYHW直接杀灭给药组质量浓度，μg/mL 005 0 50早期凋亡率，% 6.73±1.24 41.70±2.21＊17.37±2.37#27.80±6.04#

4 讨论

依据2015年版《中国药典》（一部）规定，山银花临床用量为6～15 g[3]，以人体平均体液50 L计算，得到临床实际用药浓度。以此为参考，设置系列等比浓度筛选SYHW最大无毒浓度进行试验。结果显示，细胞耐受的最大无毒浓度（50μg/m L）远低于人体耐受的最大无毒浓度（300μg/m L）。本研究采用3种给药方式考察SYHW的体外抗病毒作用，其中直接杀灭给药组设置的目的是确定SYHW直接作用于H1N1病毒后是否具有抑制作用，同时设置SYHW预防给药组和SYHW治疗给药组进一步明确SYHW抗H1N1病毒的作用是在细胞内还是细胞外。

抗病毒试验结果显示，SYHW具有直接抑制H1N1病毒活性的作用（ER＝52.7%），且SYHW治疗给药组ER较病毒对照组显著降低，这提示SYHW在细胞内抗H1N1病毒疗效较好，预示其可能对H1N1病毒有一定的治疗作用，而无预防作用。故在细胞周期及细胞凋亡试验中也只采用SYHW治疗给药和直接杀灭给药两种给药方式进行试验。结果显示，H1N1病毒感染MDCK细胞后将细胞阻滞于G0/G1期，阻碍细胞正常生长，且会引起细胞早期凋亡。SYHW作用于被H1N1病毒感染的MDCK细胞后，可逆转流感病毒引起的G0/G1期细胞阻滞，促进已被H1N1病毒感染的MDCK细胞进入S期，从而促进细胞有丝分裂，提高PI值。

综上所述，SYHW具有体外抗H1N1病毒的作用，且以治疗给药和直接杀灭给药抗病毒作用较好。但山银花化学成分较多，其发挥抗病毒作用的有效成分及作用机制还有待进一步研究。

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Study on the Anti-influenza A Virus H 1N1 Effect of Aqueous Extraction of Lonicerae Flos in vitro

CHEN Ling1，ZHOU Yanmeng2，OU Shuiping3，REN Li4（1.Drug Clinical Trial Institution of the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi563000，China；2.M icrobiology and Immunology Laboratory of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi563006，China；3.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College，Guizhou Zunyi 563000，China；4.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563006，China）

OBJECTIVE：To investigate the effect of aqueous extraction of Lonicerae Flos（SYHW）on anti-influenza A virus H1N1（H1N1 virus）in vitro.METHODS：Using Madin-Darby canine kid ney（MDCK）cells cultured in vitro by H1N1 virus，half of the tissue culture infection dose（TCID50）was calculated.Culturing MDCK cells for 24 h w ith differentmass concentrations of SYHW，themaximum non-toxic concentration was investigated.And then test was divided into normal cell group，virus control group，SYHW preventive adm inistration group，therapeutic adm inistration group and direct killing group（given SYHW of maximum non-toxic concentration，infecting cells by 100 TCID50H1N1 virus），and antiviral effective rate（ER）of SYHW was determ ined.Testwas divided into normal cell group，virus control group，SYHW therapeutic group and direct killing group（the same adm inistration and infection as above），changes of cell proliferation index（PI）and cell apoptosis rate were respectively determ ined.RESULTS：100 TCID50of H1N1 virus was 1.26×10－7，and themaximum non-toxic concentration of SYHW on MDCK cells was 50μg/m L（cell survival rate was 91.3%）.ERs of preventive administration group，therapeutic administration group and direct killing group were 0，80.3%and 52.7%，respectively.Compared w ith normal cell group，PI value in virus control group was significantly reduced（P＜0.05），early and late apoptotic rates were significantly increased（P＜0.05）.Compared w ith virus control group，PI value in directly killing group was significantly increased（P＜0.05），and early apoptotic rate was significantly reduced（P＜0.05）；early apoptotic rates in therapeutic adm inistration group were significantly reduced（P＜0.05）.CONCLUSIONS：SYHW shows anti-H1N1 virus effect in vitro，therapeutic adm inistration and directly killing are preferred in antiviral effect.

Lonicerae Flos；Aqueous extraction；MDCK cell；Influenza A virus H1N1；in vitro

R285

A

1001-0408（2017）16-2194-04

2016-09-09

2017-04-17）

遵义市科技计划项目（No.遵市科合社字〔2011〕26号）

＊主任药师，硕士生导师。研究方向：药剂学、药事管理学。电话：0851-8608210。E-mail：1551062041@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.09