利用正交设计优化茄子的SRAP体系

余扣花+王益奎+莫永诚+甘桂云+李文嘉+龙明华

摘 要：以Solanum melongena 自交系01为试验材料，利用正交设计L16（45）在5因素4水平上对茄子SRAP反应体系稳定性的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶及模板DNA等外部条件进行了优化试验，并对所稳定的体系进行验证。得出最佳的体系的引物的浓度为0.4 mmol/L、dNTPs的浓度为0.2 mmol/L、Mg2+浓度为2.0 mmol/L、模板DNA为40 ng、Taq酶浓度为0.25U/μL。

关键词：茄子 正交设计 SRAP

茄子（Solanum.melongena L.）作为中国重要的蔬菜作物，具有悠久的栽培史，中国拥有丰富的茄子资源[1]。随着分子标记技术的发展，SRAP标记技术在茄子种质资源上及分子育种方面利用越来越广泛。Sequence-Related Amplified-Poly- morphism（SRAP）标记在2001年开发出来后，该技术操作简便、重复性好，易于分离条带和进行检测等优点，广泛应用于茄子遗传多样性分析、构建遗传图谱、杂种优势预测等方面[2]。为了更快捷的利用SRAP标记对茄子进行科学研究。本试验运用正交设计的方法对SRAP反应体系进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用18份茄子及茄亚属材料包括Solanum melongena系列：自交系01、180、273、航茄1号、138、130、越南砧木、茄崎茄、CQ、25；Solanum integrifolium系列：BH、Z5、Z7、Z2；Solanum indicum s101；Solanum sisymbriifolium s102；Solanum torvum s103；Solanum surattense Burm s104均由广西农科院蔬菜研究所提供。PCR扩增所使用的Taq聚合酶、dNTPs、Mgcl2购自上海生物工程有限公司，SRAP引物由金开瑞生物科技有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 茄子基因组DNA的提取

基因组DNA提取采用改良CTAB法[3]。将提取的DNA用紫外分光光度计与1.5 %琼脂糖凝胶电泳进行检测，OD260/OD280是否在1.8～2.0的区间，琼脂糖电泳无拖尾和蛋白质残留，将DNA定量浓度为50 ng/μL，-40℃冰箱保存备用。

1.2.2 SRAP反应体系优化的正交设计

采用L16（45）进行正交试验设计，对主要影响SRAP反应体系的Mg2+、Taq酶、模板DNA、dNTPs以及引物浓度进行5因素4水平筛选，共16个处理，方案如表1。每个处理设置3次重复。除表中变化因素外，每个反应中添加2 μL 10 × PCR buffer，用ddH2O补足20 μL反应体系。

1.2.3 PCR扩增与电泳检测

以01基因组DNA作为模板，em3me1为引物进行SRAP反应体系的建立与正交试验，em3和me1的引物序列分别为5'-GACTGCGTACGAATTGAC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGATA-3'。PCR扩增在Applied Biosystems（美国）的4375786扩增仪上进行，选用SRAP-PCR基本的反应程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共5个循环；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增结束后，加入2 μL10 × Loading buffer，混合均匀后取1.2 μL产物进行7 %聚丙烯酰胺凝胶电泳，稳定电压220V電泳50 min。电泳结束后用1 %的AgNO3进行银染10 min，然后在显影液（12 g/L NaOH、0.2 %甲醛、0.3 g/L硼砂）显影至金黄色，相机拍照保存结果。

1.2.4 优化体系的验证

用正交试验后优化所得的最佳反应体系，对18份茄亚属单株进行DNA的SRAP扩增，重复3次。

2 结果与分析

2.1 SRAP扩增条带的直观分析

按照表1设计对16个处理进行了PCR扩增，见图1，根据条带的数量，清晰度，及背景颜色进行打分：条带丰富，清晰度高，背景颜色浅的打9分，反之，打1分[5]。对3次重复分别进行计分，得分见表1，从结果可以看出，3次结果一致性高，重复性好。假设各因素不存在交互作用的情况下，对3次结果进行直观分析：计算各因素同一水平对应的K值、平均值k和极差R，结果见表2。

极差R大小反映了各因素对正交体系的影响，R值越大，对体系影响越大；每个因素水平下的k大小反映了各水平对体系的影响情况，k值越大，反应水平越好[6]。由表2 可知，对茄子SRAP正交反应体系影响由大到小依次为：Mg2+>引物>DNA模板>dNTPs>Taq酶。

通过电泳得到茄子SRAP正交反应最佳体系为：Mg2+浓度为2.0 mmol/L，引物浓度为0.4 mmol/L，DNA模板40 ng，dNTPs的浓度为0.2 mmol/L，Taq酶浓度为0.25 U/μl。

2.2 最佳反应体系的验证

用引物em2me6（5'-GACTGCGTACGAATTT GC-3'和5'-TGAGTCCAAACCGGTAA- 3'）对18份茄亚属单株DNA用上述最佳SRAP反应体系进行扩增，结果见图2。结果显示不仅茄子材料扩增的条带清晰、多态性好，对茄亚属材料也能扩增出清晰度高、多态性好的条带，说明该稳定反应体系广泛适用于茄亚属的SRAP扩增。

3 讨论

由于PCR-SRAP反应体系是多因素共同作用的反应体系，每个因素的不同水平对SRAP反应结果都会产生影响，最优的反应体系对试验的后续进行至关重要，关系着整个试验的成败[7]。因此，优化茄子SRAP反应体系，更好的利用SRAP分子标记在开展茄子研究工作中奠定基础。本试验中，Mg2+浓度对反应体系影响最大，当Mg2+浓度为3.0 mmol/L时，扩增条带不稳定，条带数量增多，当Mg2+浓度为1.5 mmol/L时，扩增条带少，条带不清晰，此结果与邹小云[4]研究结果一致。dNTPs浓度在各水平均为显著差异，当在0.2 mmol/L与0.3 mmol/L水平上整体反应评分较高这与陈书霞[8]和王芳[2]研究结果基本一致。当浓度为0.1 mmol/L时，条带增多，且相对比较清晰，这与陈书霞研究结果有一定差异，可能是各因素相互影响的原因。引物在各水平上表现出显著性差异，浓度为0.2 mmol/L时，扩增条带变少，主要扩增出几条主带，当浓度為0.8 mmol/L时，扩增条带明显增多。DNA做为反应的模板，浓度升高扩增出的非特异性条带增多，一般DNA浓度适合范围较宽，在20～60 ng，均能扩增出清晰条带。这与何建文[9]和任羽[10]等研究结果基本一致。

优化茄子SRAP反应体系，对更好的利用SRAP分子标记研究茄子遗传多样性及分子育种，减轻试验工作量，提供更高效、准确的方法。本试验在5个因素4水平共16个处理，优化SRAP体系，得到最佳体系。

参考文献

[1] 中国农业科学院蔬菜花卉研究所.中国蔬菜栽培学（第二版）[M].北京：中国农业出版社，2010.

[2] 王芳，王岚，周延清. 利用正交设计优化大豆SRAP-PCR反应体系[J]. 种子，2014 （11）：78-81.

[3] 管志坤. 茄子种质资源遗传多样性SSR和SRAP分析[D]. 保定：河北农业大学，2012.

[4] 邹小云，邹晓芬， 陈伦林， 等. 花生SRAP-PCR反应体系的正交设计优化[J]. 分子植物育种，2010，8（4）：822-826.

[5] 吴智明，曾晶，胡开林，等. 利用正交设计优化辣椒SRAP反应体系[J]. 北方园艺，2010（11）：152-154.

[6] 桂腾琴，孙敏，乔爱民，等.正交设计优化果梅ISSR反应体系[J]. 果树学报，2009，26（1）：108- 112.

[7] 应东山，罗海燕，王明，等. 正交优化芒果SRAP扩增体系及引物筛选[J]. 热带作物学报，2014（4）：700-705.

[8] 陈书霞，崔鸿文，张延安. 利用正交设计优化辣椒的SRAP反应体系[J]. 西北农业学报，2010，19（4）：184-187.

[9] 何建文，杨文鹏，韩世玉，等. 辣椒SRAP-PCR反应体系主要影响因素的单因素和正交设计优化[J]. 种子，2009（9）：24-28，32.

[10] 任羽，王得元， 张银东， 等. 辣椒SRAP反应体系的建立与优化[J]. 分子植物育种，2004，2（5） ：689-693.