微小RNA146b通过靶向调节干扰素调节因子5控制M1型巨噬细胞极化

胡晶晶,李开学,刘若丹,熊 鹰

(深圳市第二人民医院，广东 深圳518029)

*通讯作者

微小RNA146b通过靶向调节干扰素调节因子5控制M1型巨噬细胞极化

胡晶晶,李开学,刘若丹,熊 鹰*

(深圳市第二人民医院，广东 深圳518029)

目的 为了证实miR-146b在小鼠M1/M2型巨噬细胞分化平衡中的作用和机制，我们通过分离小鼠骨髓来源巨噬细胞，在LPS和IFN-γ联合刺激下促进M1型细胞分化；并结合李斯特菌感染和内毒性休克，共同证实miR-146b对M1型巨噬细胞分化的作用。方法 分离野生型(WT)和IL-10-/-小鼠骨髓细胞，采用GM-CSF诱导成为巨噬细胞。并在IL-10-/-M1型巨噬细胞中转染miR-146b mimic；评价miR-146b对M1型巨噬细胞分化的影响，以及致炎因子TNF-γ、IL-6和IL-12等表达；采用miR-146b mimic处理李斯特菌感染和内毒性休克动物模型，评价miR-146b mimic对此模型的作用。结果 相对于scramble组，miR-146b mimic能明显抑制IL-10缺失小鼠骨髓来源巨噬细胞向M1型分化，并降低了TNFα、IL-6和IL-12等表达。miR-146b mimic也明显减弱了机体对李斯特感染的敏感性，导致肝脏和脾脏菌斑增多；此外，在高剂量LPS刺激下，miR-146b mimic延长了小鼠生存率，并且降低了致炎因子TNFα、IL-6和IL-12等表达。而且，IRF5可以作为miR-146b直接靶向因子。结论 miR-146b在小鼠M1型巨噬细胞激活过程作为一个负调控因子，起到了抑制炎症的作用。

微小RNA146b; 干扰素调节因子5；巨噬细胞；骨髓来源的巨噬细胞

(ChinJLabDiagn,2017,21:1076)

巨噬细胞是一类可以持续保持激活状态的高度异质性的细胞群。根据对微生物的信号和/或细胞因子刺激因素不同反应，巨噬细胞可以分化成经典激活的巨噬细胞(classically activated macrophages M1)和巨噬细胞(alternatively activated macrophages M 2)[1]。特异的细胞因子和微环境可以激活巨噬细胞，并且通过改变刺激因素能使不同激活状态巨噬细胞相互转化。由T辅助细胞Th1和自然杀伤细胞NK产生的干扰素(IFN-γ)能激活M1巨噬细胞；由中性粒细胞和其它抗原提呈细胞产生的肿瘤坏死因子TNFa以及经PAMPs介导的PRRs能通过激活SOCS3诱导M1巨噬细胞极化[2-5]。 M1巨噬细胞产生促炎细胞因子(IL-12，TNFa，和IL-6)和活性氧(ROS)及一氧化氮等，这些因子促进了T辅助细胞TH1和TH17活化[6,7]。尽管M1巨噬细胞消灭细胞内感染对保持机体内环境稳定是非常重要的，但同时M1巨噬细胞自身也产生促炎细胞因子参与IBD致病。而且，研究也正表明促进M1活性能加重组织损伤和增加宿主癌变发生风险以及诱发胰岛素抵抗[8-10]。M1巨噬细胞参与结肠炎的发生发展;然而，M1巨噬细胞如何促进结肠炎的发生发展的机制目前仍不完全清楚。因此，了解M1巨噬细胞内在调节机制将更深入阐明炎症性肠疾病的发病机制。Curtale等报道LPS刺激人类单核细胞后通过分泌IL-10反馈诱导miR-146b表达，并且靶向抑制TLR4信号途径而起到抗炎作用[11]，那么是否miR-146b能调节巨噬细胞的分化平衡？在此项研究中，我们将对miR-146b对小鼠巨噬细胞分化平衡的调节机制及靶点展开研究。

1 材料与方法

1.1 小鼠 C57BL/6小鼠、IL-10 -/-小鼠、IL-10R2-/-小鼠Rag -/-小鼠和OTII小鼠均购于美国Jackson Lab，饲养于标准SPF级环境。

1.2 抗体及试剂成分 IRF8、IRF5、b-actin，anti-Rabbit、anti-mouse、anti-goat二抗均购于santa cruz technology; 流式抗体IL-12p40-APC、F4/80-PE、NOS2-PE、CD11b-PE、CD11b-FITC购于美国ebioscience公司；CD4-FITC、CD4-PE购于BD公司。CD4分离磁珠购于德国Miltenyi公司。miR-146b 引物(Qiagen)。RAN 免疫共沉淀试剂盒(EMD Millipore)，RIP 试剂盒(EMD Millipore)。组织和细胞DNA 提取试剂盒(Qiagen),RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒(Life technology)。1640细胞培养基和DMEM细胞培养基购于Gibco公司。

1.3 质粒 构建质粒所需要的内切酶和相应buffer购于New Egnland Biolab公司。荧光素酶报告载体pmiR-vector report购于life technology。IRF5 siRNA购于Santa Cruz technology。Leti-IRF5由实验室自行构建。感受态细胞DH5a购于life technology。

1.4 OTII CD4淋巴细胞分离培养

处死OTII小鼠，取腹股沟和腋下淋巴结以及脾脏，制成单细胞悬液，加入30 μl 抗CD4偶联磁珠(德国，Miltenyi)，冰上孵育30 min，1xPBS洗涤2次，并用磁珠自动分选仪分选，收集CD4阳性的细胞备用。

1.5 骨髓来源巨噬细胞(BMDMS)培养

取WT和IL-10-/-小鼠骨髓，经过淋巴细胞裂解液破坏红细胞，1 500 rpm/min 离心5 min，以2*106细胞/ml培养基(包含10%FBS、10 ng/ml鼠重组GMCSF)，种植于相应培养板，每隔3天换更换培养基，共培养7天。

取WT和IL-10-/-小鼠骨髓，经过淋巴细胞裂解液破坏红细胞，1 500 rpm/min离心5 min，以2*106细胞/ml培养基(包含10%FBS、10 ng/ml鼠重组GMCSF)，种植于相应培养板，每隔3天换更换培养基，培养至第5天，转染miR-146b模拟物，终浓度为1 nm，直到第7天，加入新鲜10%FBS的DMED培养基，并加入100 ng/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ刺激24 h。分离来源于OTII小鼠CD4+T细胞，按照每孔细胞与巨噬细胞混合培养3天。

1.6 流式细胞术

检测CD4,IL-12/23p40,F4/80,MHC II,IL-17和IFN-γ表达于上述收集的细胞，将细胞均匀分为2管；一管分别加入10 μl的IL-12/23p40-APC、F4/80-PE、MHCII-FITC 4℃，避光孵育1 h；另外一管刺激培养后分别加入10 μl的IL-17-PE、IFN-γ-APC 4℃，避光孵育1 h，1 000 rpm/min，离心5 min，洗去未结合的抗体；重复上一步骤；弃上清，0.4%甲醛PBS 200 μl重悬细胞，于流式细胞仪(BD FACS Arail III)检测表面分子表达情况，FlowJo 7.6软件分析数据。

1.7 RNA抽提和qPCR

收集细胞加入1 ml Trizol (invitrogen)溶液，用超声组织破碎仪匀浆组织室温静置5 min；加入200 μl氯仿，剧烈振荡混匀30 s，室温静置3-5 min；4℃下，14 000 g离心15 min，可见分为3层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10 min；4℃下，14 000 g离心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗涤两次(12 000 g离心5 min)，超净台风干；视沉淀量加入适量DEPC水(至少15 μl)溶解沉淀。逆转录和定量PCR检测：根据说明书进行。

1.8 李斯特菌感染实验

10只IL-10-/-小鼠分成两组，每组5只，一组均注射7 nmol miR-146b模拟物：70 μl vivofectimine混合物，另一组注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，10只小鼠均通过尾静脉注射5*104U李斯特菌。观察48 h后处死小鼠，抽取外周血，留取肝脏和脾脏，一部分用于提取RNA；另一部分分别支撑细胞悬液，按照1/10倍连续稀释原液，每一个浓度取100 μl均匀涂抹到琼脂糖培养板，37℃过夜孵育，次日观察菌落及计数；并检测相应指标。

1.9 内毒素休克实验

12只IL-10-/-小鼠分成两组，每组6只，一组均注射7 nmol miR-146b模拟物：70 μl vivofectimine混合物，另一组注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只LPS，观察小鼠生存率。另外，6只IL-10-/-小鼠分成两组，每组3只，一组均注射7 nmol miR-146b模拟物：70 μl vivofectimine混合物，另一组注射7 nmol miR-scramble：70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射200 ng/只 LPS，4 h后，处死小鼠，留取外周血以及脾脏。并检测相应指标。

1.10 统计学分析 采用 SPSS13.0统计软件，不同组间表达的差异用非参数Kruskal-Wallis检验,生存分析采用Kaplan-Meier分析。所有的统计结果选取检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 miR-146b在WT和IL-10-/-小鼠BMDM中表达结肠组织中的表达情况

miR-146b在WT小鼠BMDM中表达随着刺激时间增加而增高；但是在IL-10-/-小鼠BMDM中，表达低于WT小鼠BMDM，并不随刺激时间增加而改变。荧光原位杂交结果显示miR-146b在巨噬细胞核表达，同时miR-146b在IL-10-/-小鼠BMDMs明显下降。这些结果提示IL-10调节miR-146b的表达，可能参与巨噬细胞分化(图1)。

取来源于WT和IL-10-/-骨髓巨噬细胞，采用LSP 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬细胞，采用qPCR(A)和荧光原位杂交(B)检测miR-146b的表达，U6作为内参照。

图1 miR-146b在M1型巨噬细胞中的表达

2.2 miR-146b mimic能抑制IL-10-/-M1型巨噬细胞分化

在IL-10-/-巨噬细胞培养到第五天时，转染miR-146b mimic，继续培养2天后用LPS和IFN-r刺激，是否miR-146b能调节M1巨噬细胞分化？我们将WT和IL-10-/-骨髓来源巨噬细胞转染mir-146 b模拟物(mimic)。转染2天后,细胞在LPS (100 ng/ml)和IFNg(20 ng/ml)联合刺激下24 h。通过流式细胞仪和ELISA分析结果表明,IL-12 p40+细胞比例在miR-146b模拟物处理组明显减少(图2)。同样,在miR-146b模拟物处理组中，细胞上清中IL-12 p40、TNFa和IL6分泌均显著下降(图3)。这些结果表明miR-146 b可以负性调节M1巨噬细胞分化。

2.3 IRF5可以作为miR-146b的靶基因

生物信息学分析认为，人IRF5可以作为miR-146b预测靶点，而人和小鼠miR-146b成熟序列具有高度同源性，我们采用序列对比发现，在小鼠IRF5也存在与人类似的miR-146b结合位点(图3)，因此，我们推测，在小鼠IRF5也可以作为miR-146b的一个预测位点。为了证实这个假设，我们构建了IRF5 3′UTR端包含miR-146b预测结合位点的荧光素酶报告基因载体及结合位点突变载体 ，将IRF5 3′UTR载体或突变载体与pre-miR-146b共转染到HEK293细胞，结果显示IRF5 3′UTR质粒与pre-miR-146b共转染组荧光强度明显低于IRF5 3′UTR突变质粒与pre-miR146b共转染组(图3)。进一步采用RNA染色体免疫共沉淀技术(RIP)分析认为miR-146b与IRF5mRNA共存于miRISC转录复合体中。此外，在IL-10-/-骨髓来源M1巨噬细胞转染miR146b模拟物48 h后，继而LPS/IFN-γ刺激48 h，两组细胞中IRF5表达均明显下降，同时IL-12 p40+细胞比例和细胞上清IL-12 p40、TNFa和IL6分泌均显著下降；并且在miR-146b模拟物转染组同时转染IRF5过表达质粒能使IL-12 p40+细胞比例和细胞上清IL-12p40、TNFα和IL-6分泌显著上调(图3)。这些结果提示了IRF5可以作为miR-146b的靶基因，参与了miR-146b调节M1巨噬细胞分化的信号途径。

采用LSP 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬细胞，分别转染miR-146b mimic和Scramble到巨噬细胞中，48 h后采用流式细胞仪检测CD11b+IL-12p40+细胞比例(A,B);并采用ELISA检测IL-12 p40、IL-6和TNFa的表达(C),重复3次。

图2 miR-146b mimic抑制肠道M1型巨噬细胞激活

A,生物信息学分析认为miR-146b与IRF5基因3′UTR区域部分核苷酸匹配。B,构建IFR5基因3′UTR荧光素酶报告基因载体，与miR-146b共同转染于HEK293T细胞，并检测荧光。C,采用RIP技术检测miR-146b与IRF5在抗Ago2抗体复合物中的表达。D,用western blot检测IRF5表达。F,取来源于WT的IL-10-/-骨髓的巨噬细胞，采用LPS 100 ng/ml和IFN-g 20 ng/ml刺激巨噬细胞，分别转染miR-146b mimic和Scramble到巨噬细胞中，6 h后，采用CHIP检测.E,48 h后采用流式细胞仪检测CD11b+IL-12p40+细胞比例重复3次

图3 IRF5是miR-146b的靶基因

2.4 miR-146b mimic 降低了小鼠对李斯特菌的易感性

经尾静脉注射5*104U李斯特菌感染小鼠，结果发现转染miR-146b mimic 的小鼠减弱了对李斯特菌的抵抗性；miR-146b mimic转染组中小鼠肝脏和脾脏表面菌斑明显多于对照组；但是炎症相关因子IL12B、TNFa和IL6的表达明显低于对照组。这说明了miR-146b可能通过抑制巨噬细胞的活性，从而减少炎症因子释放，导致对李斯特菌感染的抵抗性减弱(图4)。

A.10只IL-10-/-小鼠分成两组，每组6只，一组均注射7 nmol miR-146b模拟物:70 μl vivofectimine混合物，另一组注射7 nmol miR-scramble:70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只 LPS,A,计算脾脏和肝脏表面的菌落；B,采用ELISA检测IL-6和TNFa的水平；C,采用荧光免疫组织化学检测INOS+F4/80+细胞比例。

图4 miR-146b mimic 阻止李斯特菌感染

2.5 miR-146b mimic 降低了小鼠对内毒素休克的抵抗性

结果显示miR-146b mimic延长了小鼠在大剂量LPS刺激下的生存时间，并且减少小鼠外周血中IL12B、TNFa和IL6释放，采用qPCR发现脾脏中IL12B、TNFa和IL6 mRNA表达在miR-146b mimic处理组下降。这说明了miR-146b mimic可能通过巨噬细胞的活性减弱LPS的敏感性(图5)。

A.12只IL-10-/-小鼠分成两组，每组6只，一组均注射7 nmol miR-146b模拟物：70 μl vivofectimine混合物，另一组注射7 nmol miR-scramble:70 μl vivofectimine混合物。48 h后，腹腔注射1 mg/只 LPS,采用Kaplan-Meier分析小鼠生存率。B，C,qPCR和ELISA分别检测TNFa、IL-6和IL-12的表达

图5 miR-146b mimic阻止内毒性休克

3 讨论

微小RNA(microRNA)是近几年新发现的一类(22-24 nt)组成的非编码小RNA序列，广泛存在生物体内，在细胞生命进程如进化、细胞增殖以及凋亡等方面发挥至关重要的作用。microRNA通过碱基互补方式绑定其靶基因3′UTRs，抑制靶基因mRNA降解或者阻碍其翻译，从而降低了靶基因的蛋白表达[12-15]。它们被顺序地从由核糖核酸酶III(RNA酶III)Drosa酶和Dicer的转录处理，并且它们发挥它们的功能，通过Argonaute(AGO)蛋白组建miRNA诱导沉默复合物(miRISC)，引导microRNA与其靶基因至同一复合体中，miRISC降解或者阻碍靶基因mRNA翻译成蛋白质[16,17]。越来越多的研究也表明microRNA在机体免疫反应中也起到重要作用，特别是在调节Toll样受体(TLRs)介导免疫反应的强度和时间的作用及机制方面正吸引着大量科学家的研究兴趣[18]。已有研究表明IL-10能抑制TLR诱导的miR-155的表达从而促进抗炎基因的表达[19,20]。

那么，在影响M1巨噬细胞分化过程中，miR-146b是如何作用于M1巨噬细胞相关基因？已有文献和我们研究认为，转录因子干扰素调节因子5(IRF5)被明确认为是M1巨噬细胞分化的关键转录因子。我们检测是否IRF5表达能影响IL-10-/-M1巨噬细胞分化？结果显示WT和IL10-/-骨髓来源M1巨噬细胞LPS (100 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)联合刺激下，IRF5表达在WT中随着时间变化而降低，但是在IL10-/-M1巨噬细胞中则保持相对稳定；在IL-10-/-骨髓来源M1巨噬细胞转染IRF5 siRNA 48小时后，继而LPS/IFNg刺激48 h，细胞中IRF5表达均明显下降，同时IL-12 p40+细胞比例和细胞上清IL-12 p40、TNFa和IL-6分泌均显著下降。这说明了IRF5在IL-10-/-骨髓来源M1巨噬细胞分化过程起到了重要作用。我们也通过RNA免疫共沉淀分析了IRF5和miR-146b在转录复合体中的共表达，以及荧光素酶报告基因确认了miR-146b能绑定IRF5的3′UTR靶向序列。这些结果均证实了IRF5可以作为miR-146b调节巨噬细胞分化平衡的一个重要靶向基因。

我们通过体内外实验检测了miR-146b在M1型巨噬细胞分化中的影响，通过分离骨髓来源巨噬细胞，在体内证明了miR-146b可以抑制M1型巨噬细胞分化，减少致炎因子TNFa、IL-6、NO等。并进一步通过建立李斯特菌感染模型和内毒素休克模型，证实了miR-146b可以作为调节M1型巨噬细胞分化的一个重要因素。

因此，我们认为在巨噬细胞分化过程中，IL-10诱导miR-146b表达，并通过靶向调节M1型巨噬细胞关键因子IRF5，从而调控M1/M2型巨噬细胞分化平衡，控制致炎因子TNF、IL-6、NO等产生，以避免M1型巨噬细胞过度激活而释放炎症因子对机体的损伤。

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miR-146b controlled the polarization of M1 type macrophage via targeting IRF5

HUJing-jing,LIKai-xue,LIURuo-dan,etal.

(TheSecondPeople'sHospitalofShenzhen,Shenzhen518029,China)

Objective To investigate the function of miR-146b in the balance of M1/M2 type macrophage differentiation,we isolated the BMDMs and was stimulated by LPS and IFN-g，and confirmed the M1 type macrophage together with Lister infection and endoxin shock model.Methods BMDMs were isolated and stimulated by GM-CSF from WT and Il-10-/-mice.miR-146b mimic or scramble was transfected in IL-10-/-macrophage.The level of TNF-γ,IL-6 and IL-12 were accessed respectively by qPCR,ELISA or Flow cytometry analysis.miR-146b mimic also was used to treat the Lister infection and endoxin shock model.Results the results showed that miR-146b mimic could obviously inhibit the differentiation of M1 type macrophage,accompany with the decrease of TNFa,IL-6 and IL-12 expression.miR-146b mimic also could enhance the Lister infection by repressing the expression TNFa,IL-6,etc.but could prolong the survival of endoxin shock murine model compared to scramble group.Further,IRF5 was verified to sever as the target gene of miR-146b.Conclusion miR-146b negatively regulated the inflammatory cytokine and inhibited the inflammation.

miR-146b; IRF5;macrophage;BMDMs

1007-4287(2017)06-1076-07

R392

A

2016-12-19)