鲍曼不动杆菌生物被膜与外膜蛋白基因caro关系的研究

赵玉杰，冯雁京，刘 原*，和 平，张立然，杨 妮，敬 蓉，马淑珍，刘聪蕊

(1.西安交通大学第二附属医院 呼吸内科；2.西安交通大学第二附属医院 重症医学科；3.西安交通大学第二附属医院 急诊科，陕西 西安710004)

鲍曼不动杆菌生物被膜与外膜蛋白基因caro关系的研究

赵玉杰1，2，冯雁京1，刘 原1*，和 平1，张立然1，杨 妮3，敬 蓉1，马淑珍1，刘聪蕊1

(1.西安交通大学第二附属医院 呼吸内科；2.西安交通大学第二附属医院 重症医学科；3.西安交通大学第二附属医院 急诊科，陕西 西安710004)

目的 研究鲍曼不动杆菌生物被膜形成与外膜蛋白基因caro表达的关系。方法 结晶紫染色法检测鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)比较临床分离鲍曼不动杆菌在生物被膜形成的不同阶段外膜蛋白基因caro表达水平。结果 66.13%的临床分离鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力阳性；随着生物被膜形成的成熟，外膜蛋白基因caro的表达水平下调。结论 临床分离鲍曼不动杆菌生物被膜形成与外膜蛋白系统密切相关。

鲍曼不动杆菌；生物被膜；外膜蛋白

(ChinJLabDiagn,2017,21:1060)

鲍曼不动杆菌是一种需氧非发酵的革兰阴性条件致病菌，易引起患者呼吸道、泌尿道、血液、伤口等感染的发生[1]。由于临床上各类抗生素的广泛使用所产生的选择性压力，鲍曼不动杆菌的耐药形势日益严峻[2]。目前有研究表明，鲍曼不动杆菌的致病力和耐药性与生物膜的形成有关[3]。鲍曼不动杆菌的生物被膜形成与金属离子、质粒、整合子等基因以及外膜蛋白表达水平有关[4]。本实验比较鲍曼不动杆菌在生物被膜形成的不同阶段，外膜蛋白基因caro的mRNA表达量变化，以期为研究鲍曼不动杆菌的耐药机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2014年1月至2014年6月西安交通大学第二附属医院临床送检标本中分离鉴定的非重复性鲍曼不动杆菌共 124株，鲍曼不动杆菌A601(由西安交通大学医学院微生物实验室提供)为生物被膜阳性对照株。

1.1.2 主要仪器 Vitek-2细菌全自动鉴定仪(法国梅里埃生物公司)，PTC-200梯度PCR仪(美国MJ Research公司)，PAC300型电泳仪(美国Bio-Rad公司)，GelDoc2000凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公司)，96孔板酶标仪(德国BMG Lab Technologies公司)，ND-1000分光光度计(德国Implen公司)。

1.1.3 主要试剂 MH琼脂粉，LB培养基，0.25 g/L结晶紫染液，分析纯无水乙醇，溴化乙锭，Premix Taq Version 2.0，DL2000 DNA Marker，DNA提取试剂盒，RNAiso plus，cDNA逆转录试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜形成能力的测定

生物被膜形成能力测定：将124株临床分离鲍曼不动杆菌制备浓度为1*109CFU/ml的过夜菌液，取20 μl接种于聚乙烯96孔板(每孔含180 μl LB培养基，边孔加入等量PBS缓冲液)，每株菌做6个复孔，37℃静置培养，24 h换液，于第5天测定其再590 nm 处的吸光度(OD)值。测定前用无菌蒸馏水轻洗3次，除去浮游菌,自然风干后加入0.25 g/L结晶紫染液200 μl,室温染色20 min,用蒸馏水洗去染液，自然风干后用95%乙醇萃取10 min。重复测定3次。结果判定参照文献[6]，空白对照OD值的均值±标准差定义为ODc,待测菌株的OD值与ODc比较，OD≤2*ODc为生物被膜形成阴性株；OD>2*ODc为生物被膜形成阳性株，其中，2*ODc4*ODc为生物被膜形成能力强菌株。

生物被膜菌的制备：根据生物被膜形成能力测定结果，随机选择20株生物被膜形成能力阳性的菌株。制备浓度为1*109CFU/ml的过夜菌液，取200 μl接种于聚乙烯6孔板中，37℃静置培养，24 h换液，每株菌做3个复孔。待生长至第3天和第5天时，分别用细胞刮刮取6孔板底部及孔壁上的生物被膜菌，打散备用。

1.2.2 外膜蛋白caro 基因检测

对随机抽样生物被膜形成能力阳性的20株鲍曼不动杆菌，基因组DNA提取按照DNA提取试剂盒步骤进行。caro基因引物序列见表1。PCR反应总体积为25 μl，其中2*Taq Mix 12.5 μl，模板DNA2 μl，上下游引物各0.5 μl，灭菌蒸馏水补足至25 μl。另设空白对照。PCR反应条件：94℃3 min酶激活、DNA预变性；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶(含溴乙锭0.5 μg/ml)进行电泳分析，凝胶成像分析系统观察并照相。随机挑选1例PCR阳性产物进行纯化和序列测定。测序结果在GenBank数据库中进行对比。

表1 外膜蛋白caro基因的引物序列

1.2.3 RT-PCR检测鲍曼不动杆菌外膜蛋白基因caro的表达水平

按照RNAiso plus试剂盒提取生物被膜菌和相应液相培养菌的总RNA。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用ND-1000分光光度计检测RNA纯度和浓度，RNA纯度及完整性符合要求的进行逆转录。用逆转录试剂盒(Takara)合成cDNA置于-20℃冰箱保存。

RT-PCR扩增：引物设计参照表1，16sRNA用做内参照。按不同比例稀释cDNA使其终浓度约为100 ng/ul,反应体系和反应条件与普通PCR扩增反应一致。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，用凝胶成像分析系统观察并照相。经光密度仪扫描，目的基因的相对表达量用(IA比值)=目的基因IA/内参照基因IA。

2 结果

2.1 生物被膜形成能力测定

对培养至第5天的124株临床分离鲍曼不动杆菌进行生物被膜形成能力测定，33.87%(42株)生物被膜形成阴性，66.13%(82株)生物被膜形成阳性，其中19.35%(24株)生物被膜形成能力强，46.77%(58株)生物被膜形成能力弱。

2.2 外膜蛋白基因caro的PCR扩增

对随机抽样的20株鲍曼不动杆菌进行caro基因扩增，其中17株扩增出位于750 bp左右的阳性DNA片段。扩增电泳图见图1。随机抽样1例扩增阳性产物进行测序，与GenBank登录号为EF646275的鲍曼不动杆菌外膜蛋白基因caro比对，同源性达99%。

2.3 外膜蛋白基因caro的RT-PCR结果

采用RT-PCR方法检测鲍曼不动杆菌不同生物被膜形成时期外膜蛋白基因caro的表达水平结果显示：随着生物被膜的逐渐成熟，外膜蛋白基因caro的表达水平逐渐降低。电泳结果如图2。

注：M：DNA标记物；1-16：分别为临床分离菌株图1 鲍曼不动杆菌caro基因PCR产物电泳图

注：M：DNA标记物；1-4：浮游菌状态caro基因表达；5-8：生物被膜第3天caro基因表达；9-12：生物被膜第5天caro基因表达；14-25：内参16sRNA表达。

图2 鲍曼不动杆菌caro基因RT-PCR产物电泳图

鲍曼不动杆菌caro基因的mRNA相对表达量数据见表2所示。在浮游菌状态下，外膜蛋白基因caro表达量较高；生物被膜形成的第3天，基因caro的mRNA相对表达水平较前减低，为浮游状态下的0.76倍，减低幅度较大；到生物被膜形成的第5天，基因caro的表达量继续减弱，为浮游状态下的0.65倍，减低幅度较小。对生物被膜形成不同时期外膜蛋白基因caro的mRNA相对表达量进行方差分析，外膜蛋白基因caro在生物被膜生长的不同时期其表达水平的差异有统计学意义(P值<0.05)；进一步组间比较显示，外膜蛋白基因caro表达水平在浮游菌和生物被膜第3天，浮游菌和生物被膜第5天差异有统计学意义(P值均<0.05)，而在生物被膜第3天和生物被膜第5天其表达水平差异无统计学意义(P值=0.212)。

表2 鲍曼不动杆菌不同生长天数caro基因的相对灰度值(均值±标准差)

注：1.P值采用完全随机设计方差分析计算。2.用LSD法多重比较不同生长天数caro基因的相对灰度值，浮游菌和第3天以及浮游菌和第5天的P<0.05，第3天和第5天，P>0.05，第3天和第5天caro基因的相对表达量差异无统计学差异。

3 讨论

鲍曼不动杆菌广泛存在于自然界、医院环境及人体皮肤、粘膜、呼吸道、泌尿道中，其所引起的院内获得性感染已成为患者高发病率、高病死率的主要原因之一，特别是ICU和免疫力低下患者。由于其耐药机制复杂，获得耐药性速度快，对临床目前使用抗菌药物广泛耐药，已成为临床治疗的难题，应引起高度重视和关注。

生物被膜是由细菌通过自身分泌的胞外多糖基质、脂蛋白和纤维蛋白质等复合物，使细菌相互粘连并将其自身的克隆产物聚集缠绕而形成的膜样物结构。细菌形成生物被膜后，由于生物被膜物理屏障作用和生物被膜内部特殊的微环境，可能使其耐药性发生改变。研究证实具有生物膜形成能力的鲍曼不动杆菌菌株的耐药率显著高于无生物膜形成能力的菌株[4]。同时，细菌在形成生物被膜后，部分基因的表达水平和质粒的传递率与浮游菌状态有所不同；Hendrickx等[5]发现生物被膜菌的质粒传递与浮游状态菌相比较，其传递效率明显增高。李乐等[6]发现鲍曼不动杆菌在形成生物被膜状态下Ⅰ类整合子的表达量是浮游状态下的9倍，Lee等[7]研究显示在能形成生物被膜的鲍曼不动杆菌中，常有blaPER-1基因的高表达，提示二者可能存在某种联系。此外，有研究显示[8]生物被膜状态的鲍曼不动杆菌相对于浮游菌有32种蛋白表达上调，20种蛋白质表达下调。

目前关于鲍曼不动杆菌在生物被膜形成的不同阶段其外膜蛋白基因caro表达量的变化尚无报道。本实验选择生物被膜形成速度最快的第3天和生长成熟的第5天为观测点，采用RT-PCR方法比较生物被膜形成不同时期caro基因mRNA表达量的变化。我们发现随着生物被膜的逐渐成熟，外膜蛋白基因caro表达水平逐渐下调。可能的原因有以下几点：(1)生物被膜内的细菌形成微菌落后，在菌落内部细菌个体在生长过程中会分泌一些小分子信号扩散至菌体周围环境中，当小分子信号浓度增高达到一定阈值，就会调节某些特定基因的表达。Soren等[9]发现生物被膜状态下这些小分子信号的浓度高于浮游状态，在生物被膜状态下细菌的基因水平转移和DNA合成更频繁。(2)细菌通过改变外膜蛋白的结构或者调节外膜蛋白的表达，来减少抗生素透入菌膜从而逃逸抗生素的杀菌作用[10]；此外，外膜蛋白是小分子亲水物质进出细菌的通道，对生物被膜的形成有一定影响。

综上所述，生物被膜形成与外膜蛋白系统密切相关，共同介导鲍曼不动杆菌对抗菌药物的高水平耐药。然而鲍曼不动杆菌生物被膜形成与外膜蛋白基因的相互调控机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

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Correlations of Acinetobacter baumannii biofilms to outer membrane proteins

ZHAOYu-jie,FENGYan-jing,LIUYuan,etal.

(TheSecondAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

Objective To study the correlation between biofilm formation and outer membrane protein gene caro expression in Acinetobacter baumannii.Methods We use the crystal-violet straning method to estimate the biofilm formation ability of A.baumannii.Reverse transcription polymerase chain reaction was applied to detect the expression level of caro gene throughout the course of biofilm formation.Results Majority (66.13%) of A.baumannii strains formed biofilm in vitro,the expression level of outer membrane protein gene caro was lower in biofilm strains than their planktonic counterparts.Conclusion Biofilm formation among the clinical isolates of Acinetobacter baumannii is closely correlated with outer membrane proteins.

Acinetobacter baumannii;Biofilm;Outer membrane protein gene

国家自然科学基金(81270061)陕西省科技攻关项目(2010K16-01(02))

*通讯作者

1007-4287(2017)06-1060-04

R378

A

赵玉杰(1987-)，女，住院医师,硕士研究生，研究方向：肺部耐药菌感染的诊断与防治。

2016-09-14)