三重qPCR法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立与应用

邹享珍，蔡淑英，刘妙娥，林丹丽，桑 慧

(东莞樟木头医院 检验科，广东 东莞523633)

三重qPCR法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立与应用

邹享珍，蔡淑英，刘妙娥，林丹丽，桑 慧

(东莞樟木头医院 检验科，广东 东莞523633)

目的 建立三重qPCR法(实时荧光定量)快速检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因，期以快速精准诊断呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染，为早期精准治疗提供依据。方法 根据GenBank公布的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因序列选择保守区设计测序引物，高保真扩增东莞樟木头医院分离到的95株肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA 基因，经测序比对后，避开变异区和突变点分别设计检测引物和探针，建立三重qPCR方法直接检测临床呼吸道样本，并与培养及测序法比较，验证其诊断灵敏度和特异性等性能指标。结果 三重qPCR法检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因，其检测下限低至2 cfu/PCR，检测灵敏度98.9%(94/95),检测特异性97.9%(93/95)；诊断灵敏度98.6%(424/430)，诊断特异性98.8%(2295/2324)；从样品处理到报告结果≤1.2 h。结论 该方法简便、快速、灵敏度高、特异性好，可实现呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染的快速与精准诊断，为早期精准治疗赢得时间。

肺炎克雷伯氏菌；精准诊断；qPCR；rcsA基因；23s RNA基因

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的病原菌之一，可引起较严重的下呼吸道感染甚至死亡，其临床症状与其他细菌感染并无两样，临床难以针对该菌精准治疗。近年来，由于无法早期精准治疗，其耐药问题日益突出，严重影响了治疗效果[1，2]。培养法是目前常用的检测方法，也是金标准，一般需要2-3天，甚至更久，其时效性、简便性、灵敏度等均无法满足临床快速精准诊断的需求[3]。实时荧光定量PCR(qPCR)以其快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，在病原微生物基因快速检测方面迅速发展，已成为金标准方法的重要补充[4-6]，比如，国内已公布两项专利应用于肺炎克雷伯菌的辅助诊断[7，8]。但笔者发现，两项专利技术只检测单基因，且均未对我国流行分布的肺炎克雷伯菌相关基因进行测序比对，仅根据NCBI或文献资料来设计引物和探针，由于生物进化、地区分布不同等原因，可能存在灵敏度不够或特异性不强的致命缺点。在精准医学日益发展的当下，现有发明已无法满足需求，发明新的能实现精准诊断并适合我国人群的方法迫在眉前。由此，笔者基于Taqman 荧光探针技术，同时检测肺炎克雷伯菌rcsA和23s RNA两个持家基因，在进一步提高检测和诊断灵敏度、特异性方面取得了较好效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 留取2015年1月 -2016年12月期间来东莞樟木头医院就诊的呼吸道感染患者下呼吸道样本2754例，其中，男性1051例，女性1703例，年龄0.7-85岁。

1.1.2 仪器与试剂 ①细菌培养基产自江门凯林公司，类型：血平板、麦康凯平板和普通营养琼脂；细菌鉴定药敏分析仪产自英国SENSITITRE公司，型号：AutoReader；细菌鉴定卡为原配细菌鉴定卡。②核酸提取仪产自深圳市汇研科创公司，型号：ExPure-20；提取试剂为配套的磁珠法呼吸道样本核酸提取及细菌培养物核酸提取试剂盒。③荧光定量PCR仪产自Roche公司，型号：LightCycler480及上海宏石公司出产的SLAN-965；多重荧光定量PCR 体系(5*qPCR MIX)购自上海灵钰生物技术公司；高保真体系(Super-Fidelity DNA Polymerase)购自Vazyme公司；EvaGreen荧光染料购自美国Biotium公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集和选取 痰液样本采用吸痰或深咳法留取于无菌痰培养瓶内，经涂片革兰氏染色镜检，白细胞 >25个/HP ，鳞状上皮细胞<10个/HP判为合格，否则弃用；肺泡灌冼液直接注入无菌痰培养瓶内。

1.2.2 细菌培养与鉴定 将合格的痰液或肺泡灌冼液接种于血平板和康凯平板，置35℃ CO2孵箱培养24-48小时，挑取可疑菌落，进行革兰氏染色、氧化酶和触酶试验，根据实验结果选择相应的细菌鉴定卡上机鉴定。所有操作按仪器和试剂SOP 文件进行。

1.2.3 核酸提取与纯化 ① 痰液细菌基因组核酸提取：在痰液收集瓶中约加入等体积痰液液化剂(含N-乙酰-L-半胱氨酸1.0%，乳化剂0.25%，灭菌剂0.2%，EDTA 10 mmol/L)，漩涡振荡5 min，吸取液化痰液100 μl 至上述磁珠法呼吸道样本核酸提取试剂条第一孔，上机提取细菌基因组核酸。② 肺泡灌冼液细菌基因组核酸提取：直接取细胞灌冼液100 μl同痰液细菌基因组核酸提取方法上机提取。③ 细菌培养物基因组核酸提取：挑取纯培养菌落用生理盐水调成0.5 Mcf 菌悬液，吸菌悬液100 μl至上述磁珠法细菌培养物核酸提取试剂条第一孔，上机提取细菌基因组核酸。所有操作按仪器和试剂SOP 文件进行，提取纯化后的核酸吸入无酶EP管冻存于-86℃冰箱备用。

1.2.4 质控/内标质粒构建 用DNAMN 软件生成一段1 000 bp 随机DNA序列，其中A、T、C、G 四种碱基各占25%，委托TaKaRa大连宝生物公司构建和提取质粒。

1.2.5 测序引物设计与合成 从GenBank数据库下载肺炎克雷伯氏菌rcsA和23S rRNA基因序列各50条，用DNAMN比对软件分别进行比对，避开变异区或突变点后，用Primer 5 设计rcsA、23S rRNA基因及质控/内标质粒测序引物各3对，委托TaKaRa大连宝生物公司合成。

1.2.6 高保真体系、扩增参数优化 ①rcsA和23S rRNA基因测序引物筛选与扩增参数优化：挑取对数生长期的肺炎克雷伯氏菌纯培养菌落用生理盐水调成约2.0*108cfu/ml，经平板菌落计数法确定浓度后稀释至1.0*108cfu/ml，10倍连续稀释成8个梯度浓度菌悬液，提取纯化核酸后，在高保真PCR体系中加入推荐浓度的引物、模板和EvaGreen荧光染料，用三步扩增加溶点曲线方法在不同退火温度条件下扩增梯度浓度模板，分别从3对测序引物中选一对扩增效率、线性范围与关系、非特异扩增、荧光值增幅及扩增曲线形状最均衡的引物作为最终测序引物，以该引物的最佳扩增参数作为最终的扩增参数。② 质控/内标质粒测序引物筛选与扩增参数优化：根据质粒浓度用计算法将质粒稀释至1.0*108Copies/ml ，再10倍连续稀释成8个梯度浓度，同方法①一样选出一对最好的引物并确定扩增参数。

1.2.7 高保真PCR产物测序与质控 用优化后的高保真体系和温度参数扩增95株临床分离的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23S rRNA基因，同时扩增质控/内标质粒，高保真PCR产物委托广东腾飞基因公司测序，质控/内标质粒测序结果与设计序列100%符合方接受临床分离株测序结果。

1.2.8 三重qPCR引物、探针设计与合成标记 根据测序分析比对结果，避开变异区或突变点后，用Beacon Designer 7 设计肺炎克雷伯菌rcsA和23S rRNA基因及质控/内标质粒检测引物和探针各3组，委托TaKaRa大连宝生物公司合成及标记。

1.2.9 三重qPCR体系、扩增参数优化 采用交叉组合方式，在多重荧光定量PCR 体系中加入推荐浓度的引物、探针、和上述1.2.6的梯度浓度模板及适量质控/内标，用两步法在不同退火温度条件下扩增，分别从9组检验引物、探针中选一组扩增效率、线性范围与关系、非特异扩增、荧光值增幅及扩增曲线形状最均衡的作为最终检测体系，以该体系的最佳扩增参数作为最终的扩增参数。

1.2.10 三重qPCR结果判断标准 rcsA和23S rRNA两基因及质控/内标扩增曲线均呈“S”形，CT值均≤36，扩增曲线与基线夹角均≥30°判为阳性，否则判为阴性。1.2.11 三重qPCR检测下限试验与判断 用优化的三重qPCR检测体系和参数扩增1.2.6的梯度浓度模板，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限。

1.2.12 三重qPCR检测灵敏度试验与计算 用优化的三重qPCR检测体系和参数扩增95株肺炎克雷伯菌，计算检测灵敏度。检测灵敏度=阳性数÷95*100%。

1.2.13 三重qPCR检测特异性试验 用优化的三重qPCR检测体系和参数扩增95株非肺炎克雷伯菌的其他呼吸道常见感染菌(包括：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、β溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌各10株及卡他莫拉菌5株)，计算检测特异性。检测特异性=阴性数÷95*100%。

1.2.14 三重qPCR真阳性、真阴性判断与验证 真阳性：①培养鉴定为肺炎克雷伯菌；②培养法阴性，但qPCR法阳性，经高保真扩增测序与肺炎克雷伯菌ATCC 700603标株两基因的相同片段同源性≥90%。真阴性：①培养及qPCR两种检测方法均为阴性；② qPCR检测阳性，但经高保真扩增测序与标株相同片段同源性<90%。

1.2.15 三重qPCR诊断灵敏度、特异性试验与计算 将合格的临床呼吸道样本用三重qPCR进行检测，结果与培养法不一致时，按1.2.14方式处理和判断。诊断灵敏度=真阳性数÷(真阳性数+假阴性数)*100%；诊断特异性=真阴性数÷(真阴性数+假阳性数)*100%。

2 结果

2.1 细菌培养与鉴定结果 2015年1月-2016年12月期间，共收到合格呼吸道样本2754份，分离出355株肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等其他细菌881株。

2.2 测序引物筛选结果 9对测序引物经筛选后，综合性能最好的3对引物序列见表1。

2.3 高保真体系优化结果 高保真PCR反应体系为25.0 μl，包括2*Buffer 12.5 μl、dNTP MIX(10 mM each)0.5 μl、10 μM引物各0.5 μl、53倍高保真热启动DNA聚合酶(1 U/μl)0.5 μl、50*EvaGreen 0.5 μl、模板5.0 μl，加无菌双蒸水至终体积25.0 μl。PCR扩增参数为：95℃ 2 min+(95℃ 10 s，59℃ 10 s，72℃ 30 s)*30，选择FAM通道于延伸阶段探测荧光。用该体系扩增肺炎克雷伯菌模板，扩增曲线呈“S”形，与基线夹角≥45°；水空白曲线与基线平行，无非特异扩增现象，扩增曲线见图1。

2.4 三重qPCR引物、探针物筛选结果 9组检测引物、探针经筛选后，综合性能最好的3组引物、探针序列见表2。

表2 rcsA和23S rRNA基因及质控/内标三重qPCR引物、探针表

2.5 三重qPCR体系、扩增参数优化结果 三重qPCR反应体系为40.0 μL，包括5*qPCR MIX 8.0 μl、10 μM引物各1.2 μL、10 μM探针各0.4 μL、50 Copies/ul质控/内标0.1 μL，模板20.0 μL，加无菌双蒸水至终体积40.0 μL。qPCR扩增参数为：95℃ 2分钟+(95℃ 10秒，60℃ 40秒)*40，选择FAM、VIC和ROX 三通道于退火阶段探测荧光。用该体系扩增48份呼吸道样本模板，扩增曲线呈“S”形，与基线夹角≥45°；水空白曲线与基线平行，无起跳。FAM通道扩增曲线见图2。

2.6 三重qPCR检测下限试验结果 三重qPCR检测体系扩增肺炎克雷伯菌梯度浓度模板，扩增曲线呈“S”形，各梯度间隔均匀，最低检测浓度为102cfu/ml，对应的最低检测限为2 cfu/PCR，水空白曲线与基线平行，无起跳。FAM通道扩增曲线见图3。

图3 三重qPCR扩增肺炎克雷伯梯度模板荧光曲线图

2.7 三重qPCR检测灵敏度及特异性试验结果 三重qPCR检测体系扩增95株肺炎克雷伯菌，94株阳性，检验灵敏度98.9%(94/95)；扩增95株非肺炎克雷伯菌模板，2株阳性，检验特异性97.9%(93/95)。

2.8 三重qPCR诊断灵敏度及特异性试验结果 三重qPCR检测体系扩增2754份呼吸道样本模板，从培养肺炎克雷伯菌阳性的355份样本中，检出349份阳性，6份阴性；从未培养出肺炎克雷伯菌的2399份样本中，检出104份阳性，这 104份样本经高保真扩增测序后比对后，有75份为肺炎克雷伯菌，29份为非肺炎克雷伯菌。经计算，三重qPCR诊断灵敏度为98.6%(424/430)，特异性为98.8%(2295/2324)。

3 讨论

近年来，随着抗生素、免疫抑制剂、激素的大量使用，肺炎克雷伯菌感染呈上升趋势，除可引起下呼吸道感染外，还可引发菌血症、脓毒症、肝脓肿及泌尿系感染[9]。目前，肺炎克雷伯菌的检测以痰培养技术为金标准，该方法检测周期长，操作繁琐。二十世纪末，Higuchi等[10]人发明了实时荧光Taqman探针定量PCR技术，将PCR扩增和产物的检测结合一起进行定量分析。而三重qPCR检测方法的原理，是在实时荧光Taqman探针定量的基础上，采用多孔板，利用荧光染料和探针，同时检测多个样品或者基因，针对不同基因设计具有相同或接近的退火温度和延伸时间的引物和探针的分析技术。因反应体积少，还大大的节省试剂和时间，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程度高、检测快速等特点，所以比细菌培养方法灵敏快速。

随着分子生物学技术的飞速发展，实时荧光Taqman探针技术也只应用于肺炎克雷伯菌的RNA基因的单个检测，均未对我国流行分布的肺炎克雷伯菌相关基因进行测序比对，仅根据NCBI或文献资料来设计引物和探针，由于生物进化、地区分布不同等原因，可能存在灵敏度不够或特异性不强的致命缺点。本文选取肺炎克雷伯菌的rcsA和23s RNA两个持家基因来设计引物和探针，在实时荧光Taqman探针技术的基础上，经测序比对后，避开变异区和突变点分别设计检测引物和探针，建立三重qPCR方法直接检测临床呼吸道样本，周时检测多个样品和基因。并与培养及测序法比较，验证其诊断灵敏度和特异性等性能指标。研究表明，三重qPCR检测体系经优化后检测灵敏度及特异性高为98.9%、97.9%；诊断灵敏度及特异性高为98.6%、98.8%。具有快速、简便、灵敏度高、特异性强、批量检测等优点，并在从样品处理到报告结果≤1.2 h极短时间内做出快速诊断，为临床医生的抗生素治疗方案提供快速有效的科学依据，完全可用于下呼吸道感染的初步筛选和指导临床抗生素的合理使用，有效预防多重耐药菌的产生和传播。同时为本实验室将建立一种同时检测多个细菌实施三重荧光定量 PCR方法，形成一套多通道快速检测儿童重症呼吸道感染病原体的方法提供了参考。

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东莞市樟木头科技项目(2015105101232)

1007-4287(2017)06-0993-05

R378

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2017-01-24)