CBA技术在菌阴结核病诊断中的运用研究

刘 君，裴 豪，王 俊，戴亚萍，翟桦梓，陈玉梅

(无锡市第五人民医院，江苏 无锡214005)

CBA技术在菌阴结核病诊断中的运用研究

刘 君，裴 豪*，王 俊，戴亚萍，翟桦梓，陈玉梅

(无锡市第五人民医院，江苏 无锡214005)

目的 评价CBA检测经特异抗原刺激后PBMC上清液中细胞因子浓度水平在菌阴结核病中的诊断价值。方法 将研究对象分为健康人群、肺炎患者、潜伏感染者和菌阴结核病患者四组，运用CBA技术对PBMC刺激培养后的上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g和IL-17的浓度进行检测，并对检测结果统计分析。结果 菌阴结核病患者的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g分泌水平均高于健康人群和肺炎患者组，差异有统计学意义；IL-4和IL-17无差异。 菌阴结核病患者组的IL-2低于潜伏感染组，差异有统计学意义；TNF-a、IFN-g均高于潜伏感染组，差异有统计学意义；IL-4、IL-6、IL-10、IL-17结果差异无统计学意义。结论 CBA对PBMC刺激后上清液的细胞因子检测结果能为菌阴结核病的诊断提供有效的依据，对于控制结核病疫情的发展，并实现最终消灭结核病的长远目标具有极其重要的意义。

菌阴肺结核；CBA技术；细胞因子检测

(ChinJLabDiagn,2017,21:0983)

结核病是目前威胁全球公共卫生的主要传染病之一，全球有近三分之一人感染过结核病[1]。我国结核病的流行形势非常严峻，被世界卫生组织列为结核病高负担的国家之一[2]。早发现早治疗被认为是控制结核病流行最好的方法，但是由于大部分菌阴肺结核患者没有明确的细菌学证据，诊断十分困难，这将加大我国结核病流行控制的压力。有效的菌阴肺结核诊断技术已成为当前结核病控制的难点和热点[3]。本研究运用CBA技术对经过特异性抗原刺激后单个核细胞培养上清液中多个细胞因子的变化进行检测，统计并分析结果以探讨CBA技术在菌阴结核病诊断中的运用价值，为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 本实验将研究对象分为4组：其中菌阴肺结核患者和肺炎患者来自无锡市第五人民医院2015年1月至12月收治的住院患者，健康人群和潜伏感染者来自本院体检中心的体检人群。菌阴肺结核组共57人(男30人、女27人)，平均年龄33.46±8.43岁；肺炎患者组30人(男16人、女14人)，平均年龄34.27±10.00岁；潜伏感染组40人(男18人、女22人)，平均年龄33.25±9.59岁；健康对照32人(男15人、女17人)，平均年龄32.47±11.27岁。以上所有研究对象均排除HIV感染、无糖尿病、无妊娠、无合并其他影响检测指标的疾病。

1.1.2 仪器和试剂 FC500型流式细胞仪购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司、SW-CJ-2FD型净化工作台购自苏州净化设备有限公司、ST-16型细胞离心机和HERAcell 150i二氧化碳培养箱购自Thermo Scientific有限公司、Th1/ Th2/ Th17细胞因子检测试剂盒购自美国BD有限公司，CFP-10、ESAT-6抗原蛋白购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集和培养 于检测当天早上用肝素抗凝管采集患者空腹静脉血5 ml，加入Ficoll分离液分离单个核细胞悬液(PBMC)，用细胞培养液配置成25万细胞/ml的标准溶液。取出微量板，在检测孔中加入50 μl的CFP-10、ESAT-6抗原蛋白混合溶液，阴性孔中加入50 μl的细胞培养液，阳性对照孔中加入50 μl的植物血凝素，然后再每孔加入100 μl配置好的细胞标准溶液，混匀后置于CO2培养箱中37℃培养过夜。

1.2.2 细胞因子的检测 取出培养过夜后的微量板离心，取50 μl上清液放入流式检测管，加入50 μl PE检测试剂和50 μl细胞因子捕获微球混合液，混匀后室温避光保存3 h。加入1 ml洗液，200 g离心5 min，弃上清，每管加入300 μl洗液，混匀后立即上机检测。

1.2.3 菌阴结核病诊断标准

3次痰涂片及1次培养阴性的肺结核患者。具备下列1-6中3项或7-8项中任何1项可入选。

①典型肺结核临床症状和胸部X线表现；

②抗结核治疗有效；

③临床可排除其他非结核性肺部疾患；

④PPD(5TU)强阳性，血清抗结核抗体阳性；

⑤痰结核菌PCR+探针检测呈阳性；

⑥肺外组织病理证实结核病变；

⑦支气管肺泡灌洗液检查(BALF)检出抗酸分枝杆菌；

⑧支气管或肺部组织病理证实结核病变。

1.3 统计学方法 利用SPSS18.0软件对检测数据进行统计学分析。各组人群间的数据分析采用独立样本T检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌阴肺结核患者与健康人群的检测结果比较

菌阴结核病患者的特异性抗原刺激后PBMC分泌的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g均高于健康人群，差异有统计学意义；IL-4和IL-17结果都为0，无差异，见表1。

表1 菌阴肺结核患者与健康人群各细胞因子的比较

2.2 菌阴肺结核患者与肺炎患者的检测结果比较

菌阴结核病患者组的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g均高于肺炎患者组，差异有统计学意义；IL-4和IL-17结果都为0，无差异，见表2。

2.3 菌阴肺结核患者与潜伏感染者的检测结果比较

菌阴结核病患者组的IL-2低于潜伏感染组，差异有统计学意义；TNF-a、IFN-g均高于潜伏感染组，差异有统计学意义；IL-4、IL-6、IL-10、IL-17结果差异无统计学意义，见表3。

表2 菌阴肺结核患者与肺炎患者组各细胞因子的比较

表3 菌阴肺结核患者与潜伏感染组各细胞因子的比较

3 讨论

目前，全世界已有近20亿人口受到结核分枝杆菌(Mycobacterium ruberculosis,Mtb)的感染，结核患者约2000万人[4]。根据世界卫生组织的统计，2011年约新发结核病870万，死亡140万人[1]。目前我国结核病年发病人数约为130 万，占全球发病的14.9%，位居全球第2位，活动性肺结核的患病率459/10万，其中约50%-70%为菌阴肺结核[5]。菌阴肺结核是指以痰涂片和培养法(3次涂片一次培养)查分枝杆菌均为阴性的活动性肺结核。但是“涂阴”并非是真正的不排菌，菌阴肺结核如不能早期诊断，近一半将发展为涂阳患者，成为新的传染源。目前诊断肺结核的主要方法是痰涂片染色镜检、X线胸片检查(缺乏特异性)、结核菌素皮肤试验(TST)，继而以改良罗氏固体培养基培养确诊。然而，针对菌阴肺结核涂片镜检、分离培养结核杆菌对临床诊断意义不大。因此，如有一项针对菌阴结核病检测的快速有效的诊断技术，将给目前治疗和控制结核病的流行带来巨大的帮助。

本研究所使用的流式液相多重蛋白定量技术(Cytometric Bead Array，CBA),是基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量技术，其能够对单个样品中的多个细胞因子指标同时进行检测。相比于传统的可溶性蛋白检测定量方法，CBA具有更低的检测下限。应用少量的样本，即可对所检测的样本中的多种可溶性细胞因子同时进行检测[6,7]。通过CBA对经ESAT-6、CFP-10抗原肽刺激的PBMC上清液中细胞因子的检测，我们发现菌阴肺结核患者组的TNF-a和IFN-g这两个细胞因子水平较其他3组都要高，且差异都具有显著的统计学意义(P<0.01)；IL-2的浓度均比健康人群和肺炎患者组高，但低于潜伏感染者组，差异有统计学意义；IL-6和IL-10的浓度高于健康人群和肺炎患者组，差异有统计学意义，与潜伏感染者组的浓度相当，无统计学差异。从上述数据中可以发现，结核病感染人群(包括潜伏感染组和菌阴肺结核患者组)的IL-2、TNF-a和IFN-g的浓度比其他人群高出很多，这3个细胞因子可以作为区分的主要指标。在潜伏感染组和菌阴肺结核患者组中，前者IL-2的浓度较高，后者IFN-g和TNF-a的浓度较高，且差异都有统计学意义，可以有效的区分这两组人群。因此，我们认为利用CBA技术同时检测经特异性抗原刺激后的PBMC上清液中IL-2、TNF-a和IFN-g的浓度，能为菌阴肺结核的诊断提供可靠的证据。

综上所述，由于现有针对菌阴肺结核现有诊断技术及方法都存在一定的局限性[8]。因此对新型诊断技术的研发是现阶段结核病研究的主要目标。本研究发现通过特异性抗原刺激外周血单个核细胞，运用CBA技术检测上清液中IFN-g、IL-2、TNF-a、IL-4、IL-10、IL-6、IL-17等细胞因子的分泌情况，能为菌阴结核病的诊断提供有效的依据，这对于提高我国结核病的诊断水平，及时发现、治疗、管理传染源，控制其传播流行，降低其对周围人群的危害具有积极的推动作用，对于控制结核病疫情的发展，并实现最终消灭结核病的长远目标具有极其重要的意义。

[1]World Health Organization.Global tuberculosis report 2012 [M].Geneva:World Health Organization,2012:8.

[2]Russell DG,Barry CE,Flynn JL.Tuberculosis:what we don't know can,and does,hurt us[J].Science,2010,328(5980):852.

[3]唐文芳,刘日辉,张亚男,等.结核性胸膜炎患者血清IFN-γ表达的meta分析[J].中国实验诊断学,2014,08:1278.

[4]Jones DA,Guha K,Ho TB.Notification of tuberculosis in an area of low TB incidence[J].Clin Med，2008，8:637.

[5]高爱忠.两种试验对菌阴肺结核诊断价值的比较[J].临床肺科杂志，2015，20(3)：432.

[6]Elshal MF,McCoy JP.Multiplex bead array assays:performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA[J].Method，2006，38:317.

[7]Morgan E,Varro R,Seoulvede H,et al.Cytometric bead array:a multiplexed assay platform with application in various areas of biology[J].Clin Immunol，2004，110:252.

[8]Harari A,Rozot V,Enders FB,et al.Dominant TNF-α+ Mycobacterium tuberculosis-specific CD4+ T cell responses discriminate between latent infection and active disease[J].Nat Med,2011，17(3):372.

The research of using CBA technology in the diagnosis about smear negative TB patients

LIUJun,PEIHao,WANGJun,etal.

(WuxiNo’5People’sHospital,Wuxi214005,China)

Objective To evaluate the value of CBA technology in smear negative tuberculosis diagnosis by detecting PBMC supernatants cytokine levels which stimulation by specific antigen.Methods The subjects were divided into healthy people,pneumonia patients,tuberculosis latent infection and smear-negative TB patients.To detected IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNF-a,IFN-g and IL-17 in PBMC culture supernatants after specific antigen stimulation by CBA technology,then statistical analysis the test results. Results The IL-2,IL-6,IL-10,TNF-a and IFN-g secretion levels of smear-negative TB patients were higher than those of both healthy people and pneumonia patients,the difference had statistically significant.The concentration of IL-4 and IL-17 were no difference.The concentration of IL-2 of smear-negative TB patients was lower than latent infection tuberculosis,the difference had statistically significant.The concentration of TNF-a and IFN-g were higher than latent infection tuberculosis,the difference had statistically significant.The concentration of IL-4,IL-6,IL-10 and IL-17 were no difference.Conclusion The results of cytokine test in PBMC supernatants after stimulation could provide the diagnosis of smear-negative TB patients an effective basis,had great significance to control the development of TB epidemic and achieve the eventually goals of eliminate TB.

smear-negative TB patient;CBA technology;cytokines

江苏省自然科学基金面上研究项目(BK20151113)；无锡市医管中心面上项目(YGZXM1523)；无锡市第二轮公共卫生“三名战略”优秀青年人才培养经费资助

*通讯作者

1007-4287(2017)06-0983-04

R524

A

刘君，男，32岁，硕士，主管技师，研究方向：结核病的快速诊断。

2016-12-11)