耐氟康唑白色念珠菌的耐药性分析及中药筛选研究

叶瑜剑 周芳美 许爱娥

·实验研究·

耐氟康唑白色念珠菌的耐药性分析及中药筛选研究

叶瑜剑 周芳美 许爱娥

目的 探讨更高效价的中药抑制耐氟康唑白色念珠菌的方案。方法 药敏纸片琼脂扩散法筛选出临床耐氟康唑白色念珠菌菌株，同时统计其临床耐药率。采用水提醇沉法提取5种单味药及两两配伍药物的提取液，体外测定黄连等5种中草药单独及等比例两两配伍情况下对白色念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）。结果 临床分离的29株菌中耐药6株（20.7%），中介9株（31.03%），敏感14株（48.3%）。对耐药6株菌，黄芩单药提取液有较强抑菌效果，MIC为1.95～7.81mg/ml；黄连单药提取液的MIC为0.976～31.6mg/ml；五倍子单药提取液的MIC为15.6～62.5mg/ml；黄柏单药的MIC为31.28～125mg/ml；知母单药提取液的MIC为＞500mg/ml；复方药（黄连和黄柏、黄连和知母）均有一定的抑菌效果，MIC分别为7.81～62.5mg/ml、15.6～62.5mg/ml。结论 临床中白色念珠菌耐药率为20.7%，黄连、黄芩、黄柏和五倍子四种中草药具有直接的抗耐药白色念珠菌的作用，其中尤以黄芩的抑菌作用最为显著；复方药黄连加黄柏、黄连加知母均有一定的抑菌效果。

中草药 白色念珠菌 耐药 最低抑菌浓度

念珠菌是正常人口腔、消化道及阴道黏膜常见的寄生菌，仅在适宜的条件下造成对宿主的感染，又称条件致病菌。近年来，随着广谱抗生素、类固醇激素、免疫抑制剂和放射治疗的广泛应用，使临床上念珠菌感染日益增多。文献报道［1］，白色念珠菌是临床上真菌感染的主要病原菌之一。随着氟康唑的广泛应用，临床标本中耐药白色念珠菌菌株检出率逐渐升高［2］。研究表明［3］中药不仅具有比较好的抑菌及杀菌作用，且不易产生稳定可遗传的耐药菌株。因此，人们对从传统天然药物特别是中草药中寻找抗微生物感染的新药越来越关注［4］。本文选取甲癣患者指甲的白色念珠菌进行耐药性分析，探讨对耐药氟康唑白色念珠菌作用较强的中药，为抗真菌新药的开发提供线索思路。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 选择2013年1月至2014年12月杭州市第三人民医院皮肤科甲癣患者指甲处经分离、培养、鉴定后确定为白色念珠菌的标本29例，药敏试验的质控菌克柔念珠菌ATCC2658、近平滑念珠菌ATCC22019，均由浙江中医药大学微生物与免疫学实验室提供。

1.2 药物及仪器 （1）含抗生素药敏纸片：氟康唑购自杭州微生物试剂有限公司。（2）中药：黄连、黄柏、知母、黄芩、五倍子，购自浙江中医药大学附属第三医院。（3）培养基：改良沙氏培养基（SDA）：葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，115℃灭菌15min；Mueller-Hinton 琼脂（补充2% 的葡萄糖和0.5μg/ml的美蓝）；RPMI 1640液体培养基：RPMI 1640（含谷氨酰胺，不含碳酸氢钠）10.49，MOPS 34.59（0.165mol/L），加三蒸水900ml溶解，调pH至7.0，定容至1000ml，0.22μm滤膜滤过除菌，4℃冰箱冷藏保存备用［5］。（4）主要仪器：生物安全柜（广州三元科技有限公司）、旋转蒸发器（R-201，上海申顺生物科技有限公司）、智能生化培养箱（SPX-280，Safe赛福）、低速自动平衡离心机（LDZ5-2，北京医疗离心机厂）、单相电容运转电动机（JX5024，上海申顺生物科技有限公司）、恒温水浴锅（W201B，上海申顺生物科技有限公司）等。

1.3 方法 （1）药敏纸片琼脂扩散法筛选耐药菌［6］：参照药敏试验NCCLS M44-P纸片扩散法，将所有白色念珠菌菌株做体外药物敏感实验，将纯化的白色念珠菌新鲜培养物配制成0.5麦氏单位浓度，用无菌棉签涂布接种于MH培养基上，放置10min后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于培养基表面，35℃培养，18～24h后，测定抑菌圈直径大小，参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准判断为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。克柔念珠菌ATCC2658、近平滑念珠菌ATCC22019，作为质控菌。（2）中药有效成分的提取制备：采用水提醇沉法提取中药有效成分［7］：分别取黄连、黄柏、黄芩、知母、五倍子［4］各50g，各加1000ml蒸馏水浸泡30min，煎1h，过滤。滤渣再加适量蒸馏水煎30min，过滤合并药液，然后浓缩药液至100ml，再加200ml 95%乙醇溶液，加时不断搅拌，析出杂质。静置24h，过滤后恒温水浴蒸发乙醇，乙醇蒸发完毕再加蒸馏水定容至50ml，可得1g/ml生药液，115℃，15min灭菌4℃冷藏备用。两两配伍药液制取方法是，取黄连和黄柏药品各25g、黄连和知母药品各25g，制取方法同上。（3）最低抑菌浓度（MIC）的测定：按照NCCLS M27-A采用肉汤稀释法［5］：将中药提取液用配制好的RPMI1640液倍比稀释，使其终浓度（mg/ml）为500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976。将待检菌株接种在SDA培养基上，活化2次，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达0.5麦氏比浊标准［约为（1～5）×106CFU/ml］。用RPMI1640液体稀释1000倍接种浓度约为（1～5）×103CFU/ml。在无菌聚苯乙烯板条各孔中加入各种不同浓度的中药稀释液100μl，各孔再加入待检菌100μl，另设一孔不加药液作为空白对照。每种菌株做一行复孔，平行操作一次。35℃孵育48h。结果判定：将测试孔菌株生长情况与对照孔进行比较，以培养液清澈为阴性，记为无菌落生长；混浊有菌膜为阳性，记为有菌落生长。以培养液清澈的最小浓度作为该药的最低抑菌浓度（MIC）。

2 结果

2.1 白色念珠菌的耐药结果 参照NCCLS氟康唑药敏纸片判读标准：敏感≥19mm，中介15～18mm，耐药≤14mm。结果显示，29株白色念珠菌菌，耐药6株（20.7%），中介9株（31.03%），敏感14株（48.3%），见表1。

表1 白色念珠菌的耐药结果

2.2 抗耐药氟康唑中药筛选结果 纸片扩散法筛选耐药菌株的基础上，对耐药菌株进行中药筛选。孵育48h后，菌株生长良好，MIC终点清楚，标准菌均在质控范围内。结果单药提取液中，黄芩提取液的抑菌效果最强，其次为黄连提取液和五倍子提取液，两两配伍提取液均有一定的抑菌效果，但效果一般。见表2。

表2 中药对耐药菌株的MIC值

3 讨论

白色念珠菌是存在于人体的正常真菌，属于条件致病性真菌。当人体免疫抵抗能力较弱等情况时，会引起白色念珠菌的机会性感染。随着艾滋病感染率逐年增高、肿瘤患者化疗药物的治疗、器官移植免疫抑制剂的使用增加及抗生素的滥用，导致临床上真菌感染率上升，且深部真菌感染病情较严重，病死率高。随着氟康唑的广泛应用，临床标本中耐药白色念珠菌菌株检出率逐渐升高，本资料中临床分离的白色念珠菌的耐药率达20.7%。

中药不仅具有比较好的抑菌及杀菌作用，且不易产生稳定可遗传的耐药菌株。在大量的中药体外药敏试验中发现不少中草药具有较好的抑杀真菌作用。本资料结果显示，黄连、黄芩、黄柏和五倍子四种中草药具有直接的抗耐药白色念珠菌的作用，其中尤以黄芩的抑菌作用最为显著，知母作用效果较差；复方药黄连加黄柏、黄连加知母均有一定的抑菌效果。马廉兰等［8］的实验发现，黄连、黄芩、大黄、知母等中草药对白色念珠菌和新生隐球菌均有较强的抑菌作用，其中黄连的抑菌作用最强，MIC最低。邱莹等［9］根据对20种单味中药的抑菌实验结果选取6种抑菌效果最好的中药（大风子、皂 角、川椒、藿香、地骨皮）组成复方，复方对各类真菌均有较好抑制作用，抑菌强度好于单味药，对白色奶念珠菌也有较好的抑菌效果。余园媛［10］选用白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌三种耐药菌株，观察复方黄连凝胶剂对真菌和细菌感染的治疗效果。结果显示，复方黄连凝胶剂对三种多重耐药菌株均有良好的抗菌作用，尤其是对白色念珠菌引起的感染效果更加明显。Giordani R等［11］实验发现，若实验组中含有少量肉桂精油，便可以促使两性霉素B对白色念珠菌的抑制作用更为显著。

本资料结果对外敷中药的研究有一定的指导意义，这不仅可降低西药的治疗量，还可减少不良反应，增强杀菌效果并防止耐药性发生。在今后的研究中，适当增加中药药理作用机制的研究和临床疗效的评价，使中药这种安全有效、不易出现耐药性的治疗方法更高效、更广泛地应用于临床皮肤病治疗。

［1］ 任南,文细毛.白色念珠菌致病机制的研究进展.中国感染控制杂志, 2003, 2(2):157-158.

［2］ Mavor AL, Thewes S, Hube B.systemic fungal infections caused by Candida species: epidemiology, infection process and virulence attributes.Curt Drug Targets, 2005, 6(8): 863-874.

［3］ 陈奇. 中药药理研究方法学. 北京: 人卫生出版社, 1993.

［4］ 宫毓静, 安汝国.164种中药乙醇提取物抗真菌作用研究. 中草药, 2002, 33(1): 42-47.

［5］ Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast: Approved standard M27-A. The Nation Committee for Clinical Laboratory Standards.Pennsylvania, 1997: 1-21.

［6］ NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Twelfth Informational Supplement, 2002, 22(1): 48-49.

［7］ 王文花, 李劲松, 肖晴晴, 等. 5种中药体外抗白色念珠菌的实验研究. Journal of Guangxi Traditiona1 Chinese Medical University, 2010, 13(3): 54-55.

［8］ 马廉兰, 钟有添. 六种中草药对深部感染真菌的体外抑菌效果.赣南医学院学报. 2001, 21(1): 1-3.

［9］ 邱莹, 于腾. 20种中药及其复方抗真菌实验研究. 济宁医学院学报, 2007(3): 237-238.

［10］ 于园媛.复方黄连凝胶剂体内抗菌活性研究.中国医药指南, 2008, 18(6): 47-50.

［11］ Giordani R, Regli P. Potentiation of antifungal activity of amphotericin B by essential oil from Cinnamomum eassia. Phytother, 2006, 20(1): 58-61.

Objective To investigate a method which can strongly inhibit clinically fl uconazole-resistant Candida albicans by using Chinese herbs. Methods The clinically fl uconazole-resistant Candida albicans were picked out，and the clinical resistance rate were calculated by using the K-B way. Ethanol subsiding methods were used to extract the extraction solvent of fi ve single herbs and two two compatibility herbs. Double dilution method was used to dilute the extraction solvent. At last，f i ve single herbs and two two compatibility herbs minimum inhibitory concentration（MIC）of Candida albicans were determined respectively in vitro. Results There were 6 resistant strains（20.7%），15 intermediary strains（51.7%）and 8 sensitive strains（27.6%）in total 29 strains of Candida albicans. Extracts from scutellaria baicalensis georgi and coptis root had strong inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were 1.95-7.81mg/ml and 0.976-31.6mg/ml respectively. While extracts of Galla chinensis and Phellodendron bark had a little inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were 15.6-62.5mg/ml and 31.28-125mg/ml respectively. Rhizoma anemarrhenae extract had little inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were＞500mg/ml. Two two compatibility herbs（Coptis root and Phellodendron bark，Coptis root and Rhizoma anemarrhenae）had a little inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were 7.81-62.5mg/ml、15.6-62.5mg/ml respectively. Conclusion The fl uconazole-resistant rate and fl uconazole-intermediary rate of Candida albicans are always high，while the fl uconazole- sensitive rate is always low. Coptis root，scutellaria baicalensis georgi，Phellodendron bark and Galla chinensis all have direct anti- fl uconazole-resistant Candida albicans effects. Scutellaria baicalensis georgi has most inhibitory effect on fluconazole-resistant Candida albicans，while Rhizoma anemarrhenae has little inhibitory effect. Two two compatibility herbs（Coptis root and Phellodendron bark，Coptis root and Rhizoma anemarrhenae）have a little inhibitory effect on fl uconazole-resistant Candida albicans.

Chinese traditional herbs Candida albicans Drug resistance Minimum inhibitory concentration（MIC）

浙江省教育厅一般科研项目（Y201431631）

310009 杭州市第三人民医院（叶瑜剑 许爱娥）310053 浙江中医药大学医学技术学院（周芳美）