离心法与过滤吸附法处理脂肪组织对脂肪细胞活性影响的比较

刘锋 王娜 石恒 王志军

离心法与过滤吸附法处理脂肪组织对脂肪细胞活性影响的比较

刘锋 王娜 石恒 王志军

目的 比较低速离心法（800 r/min）与过滤吸附法处理脂肪组织对移植脂肪细胞活性的影响。方法 从16例健康女性腹部或大腿部获取脂肪后，对脂肪组织分别进行离心（离心组）和过滤吸附（过滤吸附组）处理，应用葡萄糖转运法和锥虫蓝染色法检测细胞活性，并行常规HE染色观察脂肪细胞组织学变化。结果 过滤吸附组和离心组葡萄糖转运量分别为（2.00±0.36）mmol/L和（1.50±0.25）mmol/L，差异具有统计学意义（P＜0.05）。过滤吸附组和离心组脂肪细胞存活率分别为（91.0±3.0）%和（85.5±3.2）%，差异无统计学意义（P=0.417）。组织学观察显示离心组有少量脂肪细胞存在损伤，细胞膜破裂不完整；过滤吸附组脂肪细胞分布均匀，形态保持完整，基本没有损伤。结论 过滤吸附法处理脂肪颗粒与离心法相比，脂肪细胞活性较高，是一种有效且可行的脂肪处理方法。

自体脂肪移植；离心法；过滤吸附法；细胞活性；脂肪纯化

自体脂肪因容易获取、低致敏原性、可多次取材且价格相对低廉，被认为是一种较理想的填充剂[1-4]。在脂肪的处理方法上，最常用的是离心法与过滤吸附法[5]，以往对离心法与过滤吸附法的比较研究中，均对采用高速离心法（1500或3000 r/min）与过滤吸附法处理脂肪组织后脂肪细胞的活性进行比较[6-7]，而且离心速率越高对脂肪活性影响越大[8]。自2015年1～12月，我们比较了低速离心法（800 r/min）与过滤吸附法对脂肪颗粒细胞活性的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

脂肪取自16例健康女性；年龄26～56岁，平均35.5岁；体质量指数（BMI）为19.0～24.6，平均21.8。均为至成都米兰柏羽美容医院要求行腹部吸脂减肥或面部填充的患者。所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 脂肪的获取 术前标记吸脂区域（大腿内外侧或者腹部），患者取仰卧位，给予静脉麻醉，麻醉后将吸脂区常规消毒铺巾。于进针孔（腹部选择脐旁，大腿选择髂前上棘处）皮下注入1%盐酸利多卡因注射液1 ml行局部麻醉，采用11号尖刀片作长5 mm切口。采用直径为2mm的多孔注水麻醉针管行局部肿胀麻醉（肿胀麻醉配置：生理盐水500 ml+2%盐酸利多卡因注射液10 ml+1∶1000盐酸肾上腺素注射液1 ml），于皮下脂肪层均匀注入麻醉液，注射量为200 ml左右。待肿胀液充分起效后，用10 ml注射器连接直径3 mm双边开孔的三孔顿头吸脂针管，用一定负压抽吸皮下脂肪组织。

1.2.2 脂肪纯化 将抽取的脂肪静置10 min，待脂肪组织与肿胀液分离，将下层肿胀液去除后对上层脂肪进行纯化。纯化后每例患者得到的脂肪组织至少为40 ml。将20 ml脂肪组织进行离心处理（离心组），800 r/min，离心3 min。将上层的油脂和下层的液体去除，对中层的脂肪颗粒细胞进行活性检测；另将20 ml脂肪组织进行过滤吸附处理（过滤吸附组），将脂肪倒入无纺布上（下垫衬纱布），对脂肪组织进行轻轻摇晃以使脂肪颗粒中的油脂、生理盐水、局部麻醉药液等被纱布吸附（图1）。

图1 脂肪处理方法 a.离心法 b.离心处理后的脂肪组织 c.过滤吸附法 d.过滤吸附后的脂肪组织

1.2.3 葡萄糖转运法检测脂肪细胞活性 将获取的备用脂肪经离心和过滤吸附法处理后，分别取纯化好的脂肪颗粒细胞5 ml加入培养皿中，每皿中加入10 ml低糖（1000 mg/L）DMEM培养基，1U普通胰岛素。同时设置一空白组，只含胰岛素和DMEM培养基，不含脂肪颗粒细胞。所有标本摇匀后置于37℃、95%CO2恒温培养箱中孵育1 h。1 h后取出，用生化分析仪检测DMEM培养基中葡萄糖浓度。空白组中葡萄糖的浓度设置为基础浓度，基础浓度与每个实验组的浓度差值表示葡萄糖转移量，即代表脂肪颗粒细胞的活性。

1.2.4 锥虫蓝染色法检测脂肪细胞存活率 分别取经离心和过滤吸附处理后的脂肪颗粒1 ml，加入等体积的0.1%Ⅰ型胶原蛋白酶，充分混匀后置于37℃、95%CO2恒温培养箱中消化40 min。消化后用200目金属过滤筛进行过滤，过滤后的细胞悬液进行离心（1000 r/min，离心10 min）。离心完后吸取第2层脂肪细胞与0.4%锥虫蓝染液以9:1充分混匀，染色3～5 min。采用标准计数板进行计数。

1.2.5 HE染色 分别取经离心和过滤吸附处理好的脂肪颗粒5 ml，用10%甲醛溶液进行固定。常规脱水、包埋、切片，行HE染色。用光学显微镜对脂肪细胞形态变化和破坏程度进行观察。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，使用GranphPad Prism5.0软件进行绘图分析。数据采用±s表示，两组葡萄糖转移量差异采用方差分析，脂肪细胞存活率差异采用两独立样本t检验比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 葡萄糖转运实验

过滤吸附组和离心组葡萄糖转运量分别为（2.0±0.36）mmol/L 和（1.5±0.25）mmol/L，差异具有统计学意义（P＜0.001），见图2。表明过滤吸附法处理的脂肪细胞活性较高。

图2 各组葡萄糖转运量（*为两组差异具有统计学意义，P＜0.001）

2.2 锥虫蓝染色实验

过滤吸附组和离心组脂肪细胞的存活率分别为（91.0±3.0）%和（85.5±3.2）%，差异无统计学意义（P=0.417），见图 3。

图3 各组脂肪细胞存活率

2.3 HE染色

光学显微镜下观察显示脂肪细胞连接紧密，呈空泡状，细胞膜呈紫红色，细胞核呈蓝黑色，居于细胞一侧。离心组有少量脂肪细胞存在损伤，细胞膜破裂不完整；过滤吸附法组脂肪细胞分布均匀，形态保持完整，基本无损伤（图4）

图4 各组脂肪细胞的组织学观察（HE×100） a.离心组 b.过滤吸附组

3 讨论

离心可以去除肿胀液、红细胞、细胞碎片和油脂而浓缩脂肪细胞，也可通过去除红细胞和非活性成分减少炎症反应而减少吸收[9]。但离心过程较繁琐，并且Ferraro等[8]在对离心转速的对比研究中发现，高速离心（3000 r/min）会显著的降低脂肪细胞的活性，而低速离心（500 r/min）对脂肪细胞仅造成很小的影响。Kuran等[10]提出一种简单省时的脂肪处理方法，采用清洗联合滤网过滤、棉垫吸附的方法，去除脂肪中的血液、油脂等，只通过重力和棉垫的虹吸作用处理脂肪，不对脂肪行过多的外力干预。Pfaff等[6]比较了离心法（1500 r/min）和过滤吸附法处理脂肪颗粒后脂肪细胞的活性，发现过滤吸附法处理的脂肪细胞较离心法处理的脂肪细胞有更多的脂肪来源干细胞和有活性的脂肪细胞。Fisher等[7]进行了体内实验，将过滤吸附法和3000 r/min、离心3 min处理的脂肪颗粒分别注入裸鼠中，6周后对移植脂肪的体积进行测量，发现过滤吸附法处理的脂肪体积较离心法处理的脂肪体积高。Xie等[11]也比较了离心速率对脂肪细胞活性的影响，当离心速率达到1000 r/min时就会降低细胞活性，并且与速率成正比关系。因此,本研究中我们比较了低速离心（800 r/min）与过滤吸附法处理脂肪细胞后脂肪细胞的活性。

本研究结果显示，经离心和过滤吸附法处理脂肪颗粒细胞后，过滤吸附组葡萄糖转移量较离心组高，且差异具有统计学意义，这表明过滤吸附组的细胞活性较高；对细胞消化后行锥虫蓝染色观察细胞的存活率发现，过滤吸附组脂肪细胞平均存活率虽然较离心组高，但两者差异无统计学意义。分析出现此种差异的原因，我们认为低速离心时产生的离心力对脂肪细胞的机械损伤不足以破坏大部分脂肪细胞膜结构，但却减弱了脂肪细胞的活力，从而减弱脂肪细胞的代谢能力。从组织学观察结果也可看出，过滤吸附法处理脂肪组织后脂肪细胞膜结构保持更加完整。

本研究的局限性在于样本量较小，并且缺少体内的自体脂肪移植数据。但是，综合之前学者的研究结果，我们认为过滤吸附法是一种有效可行的脂肪处理方法。

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Comparison of the effects of centrifugation and filtration on the adipose tissue

LIU Feng,WANG Na,SHI Heng,WANG Zhi-jun.(Department of Plastic Surgery,Xinhua Hospital,Dalian University,Dalian 116021,China)

ObjectiveTo compare the effects of the low-speed centrifugation (800 r/min)method and the filtration adsorption method on the viability of autologous fat grafts.MethodsFat tissue was harvested from 16 healthy patients by syringe aspiration.Harvested fat tissue was prepared using two different methods:centrifugation and filtration adsorption.Glucose transport test and trypan blue stain were performed to evaluate the viability of fat grafts.ResultsThe results of the glucose transportation test of the centrifugation group and the filtration adsorption group was(2.00±0.36)mmol/L and(1.5±0.25)mmol/L,respectively.The viability of lipocyte in filtration adsorption was significantly higher than that in the centrifugation group(P＜0.05).The survival rate of fat is(91.0±3.0)%and(85.5±3.2)%,respectively.There was no significant difference between the two different methods of fat processing (P=0.417).ConclusionLipocyte purification by filtration adsorption has a higher viability than centrifugation.It is an efficient and feasible fat processing method.

Autologous fat grafts;Centrifugation;Filtration adsorption;Cell viability;Fat purification

WANG Zhi-jun,Email:wzy618@tom.com

2016-11-16）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.012.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.012

大连大学附属新华医院 整形外科，辽宁 大连 116021

王志军，Email:wzy618@tom.com

本文引用格式：刘锋，王娜，石恒，等.离心法与过滤吸附法处理脂肪组织对脂肪细胞活性影响的比较[J].中国美容整形外科杂志,2017,28(1):43-45.