超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定麻辣烫中喹诺酮类药物残留

赵 飞，高广慧，贾宏新

(辽宁省食品检验检测院，辽宁 沈阳 110015)



超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定麻辣烫中喹诺酮类药物残留

赵 飞*，高广慧，贾宏新

(辽宁省食品检验检测院，辽宁 沈阳 110015)

建立了麻辣烫中14种喹诺酮类药物残留的超高效液相色谱-串联四极杆质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。采用酸化乙腈提取麻辣烫中的喹诺酮类药物残留，提取溶液经盐析和C18固相萃取柱净化后，在电喷雾离子源中正离子模式下，采用多反应监测(MRM)方式进行测定，内标法定量。结果显示，14种喹诺酮类药物在7.5～100 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.990。在3个不同加标水平下的平均回收率为75.4%～110.0%，相对标准偏差(n=6)为1.3%～10.1%，14种化合物的检出限和定量下限分别为0.5，1.5 μg/kg。该方法操作简单、快速，净化效果好，灵敏度高，适用于麻辣烫中多种喹诺酮类药物残留的同时定性和定量检测。

固相萃取；超高效液相色谱-串联四极杆质谱法；喹诺酮类药物；麻辣烫

喹诺酮类药物是一类合成抗菌药物，其抗菌谱广，见效快，成本低，被广泛用于医疗[1-2]。同时该类药物也是卫生部公布的“食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单”中禁用于麻辣烫食品中的药物。当前对该类药物检测方法的研究中，较多的是对动物源性食品[3-9]和豆芽的检测研究，对于麻辣烫中该类药物的检测尚未见报道。不法商贩将喹诺酮类药物添加在麻辣烫类食品中用于杀菌，防止人们食用变质的该类食物后出现肠胃不适等情况。但长期摄入这类药物会影响人体正常的肠道菌群分布，并催生该类药物的耐药性。

目前，食品中喹诺酮类药物的检测方法主要有液相色谱法[3-4]、液相色谱-质谱联用法[5-10]、酶联免疫法[11]。由于不同种类的食品基质组分相差较大，检测麻辣烫中喹诺酮类药物时，不仅要求样品前处理方法要具有普适性和高效性，而且要具有较高的选择性。因此，本文以市售的麻辣烫为研究对象，对麻辣烫中喹诺酮类药物检测的样品前处理条件、分离条件和质谱检测条件进行了优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱检测麻辣烫中喹诺酮类药物的方法，并对市售200批次样品进行了检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ESI TQD三重四极杆质谱仪，XEVO超高效液相色谱仪，BEH Shield RP18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，Oasis HLB固相萃取柱，均购于美国Waters公司；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；涡旋混合仪(德国IKA公司)；高速冷冻离心机(美国热电公司)；氮吹仪(上海屹尧仪器科技发展有限公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，上海安谱科学仪器有限公司)；氯化钠、氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

14种喹诺酮类标准品包括氟罗沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.6%)、氧氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.0%)、诺氟沙星(中国食品药品检定研究院，99.5%)、依诺沙星(中国食品药品检定研究院，91.1%)、环丙沙星(中国食品药品检定研究院，84.2%)、恩诺沙星(Dr.Ehrenstorfer，98.5%)、盐酸洛美沙星(Dr.Ehrenstorfer，99.0%)、甲磺酸达氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，94.0%)、奥比沙星(Dr.Ehrenstorfer，97.8%)、盐酸双氟沙星(Dr.Ehrenstorfer，98.0%)、盐酸沙拉沙星(Dr.Ehrenstorfer，95.0%)、司帕沙星(中国食品药品检定研究院，99.8%)、氟甲喹(Dr.Ehrenstorfer，98.3%)、培氟沙星(中国食品药品检定研究院，71.1%)；3种内标物标准品氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星和氘代恩诺沙星均购自Witega。

分别精密称取各标准品、内标标准品适量，各加入0.2 mL甲酸，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度约1 000 mg/L的单标准储备液，置于棕色瓶中，于-18 ℃冰箱中保存。将上述储备液用甲醇稀释为0.5 mg/L的混合标准中间液，用于质谱参数优化。使用时根据需要，以0.1%甲酸-乙腈(95∶5)溶液逐级稀释为混合标准工作液，现用现配。

2%甲酸乙腈溶液的配制：量取490 mL乙腈，向其中加入10 mL甲酸，混合均匀即得。

1.3 样品处理

称取匀质后的试样5.00 g于50 mL离心管中，加入100 ng/mL混合内标溶液0.2 mL，加入10 mL 2%甲酸乙腈溶液，拧紧上盖，于涡旋混合仪上涡旋30 s；以7 000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一50 mL离心管中，残留物再用10 mL 2%甲酸乙腈溶液提取2次，合并3次提取液；向提取液中加入3.0 g氯化钠，拧紧上盖，于涡旋混合仪上涡旋30 s，将上清液(乙腈层)转移至另一50 mL离心管中，加入10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋30 s，弃去正己烷层，乙腈层于氮气流下吹至近干，加入5 mL水，涡旋混合30 s，10 000 r/min离心10 min，待用。

依次用6 mL甲醇、6 mL水活化HLB小柱(200 mg，6 mL)，将样品溶液转移至小柱中，以6 mL 5%甲醇洗涤小柱，抽干后，用6 mL甲醇洗脱样品，收集洗脱液于氮气流下吹至近干，用1.00 mL初始比例流动相溶解，涡旋混合30 s，过0.22 μm滤膜供LC-MS/MS分析。

1.4 空白基质匹配混合标准溶液的配制

取空白基质麻辣烫样品，按“1.3”方法处理样品，浓缩至近干，加入混合标准工作溶液1.00 mL复溶，涡旋混合30 s，过0.22 μm滤膜，即得空白基质匹配混合标准溶液。

1.5 色谱条件

色谱柱：BEH Shield RP18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈溶液；流速：0.4 mL/min。梯度洗脱程序：0 min，96%A；0～1 min,96%～90%A；1～3 min,90%～40%A；3～4 min,40%～96%A。

1.6 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描；多反应监测(MRM)；喷雾电压3 kV；离子源温度：450 ℃；雾化气流速：0.8 L/min；质谱采集参数见表1。

表1 喹诺酮类药物的质谱参数

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 色谱条件 本研究选择乙腈作为流动相有机相，分别考察了在水相中不加酸以及分别加0.1%乙酸、0.2%乙酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸后对色谱分离和质谱灵敏度的影响。结果表明，在水相中加酸后，各化合物的离子化效率明显提高，峰形更好；在水相中各添加相同体积分数的甲酸和乙酸时，由于甲酸的酸性高于乙酸，添加甲酸的效果略优于乙酸，且在质谱流动相中甲酸的使用更为普遍；向水相中添加不同体积分数的甲酸时，各化合物的离子化效率无明显变化。因此，选择加入0.1%甲酸溶液即可满足要求。

图1 麻辣烫中14种喹诺酮类药物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 14 kinds of quinolones standard

以0.1%甲酸溶液作为水相，分别以乙腈和0.1%甲酸乙腈溶液作为有机相，实验结果表明，以0.1%甲酸-乙腈作为流动相时，14种喹诺酮类化合物响应较好；以0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈溶液作为流动相时，除氟甲喹的响应较前者有明显增强之外，其余喹诺酮类药物的响应均降低，因此最终选择0.1%甲酸-乙腈为流动相。

采用选定的流动相，对混合标准溶液进行分离，优化梯度洗脱程序，使所有待测化合物均具有良好的峰形和灵敏度，优化后的梯度洗脱程序见“1.5”。由于各喹诺酮类化合物的性质相近，保留时间较为接近，本研究通过碎片离子的差异进行区分。图1为4 μg/kg添加水平下，麻辣烫中目标化合物的总离子流色谱图。

2.1.2 质谱条件 采用质谱直接进样的方式将0.5 mg/L的混合标准中间液进样，分别进行正离子和负离子全扫描分析，所有待测化合物的最佳准分子离子峰均在正离子扫描模式下获得，母离子均为[M+H]+。以各化合物的准分子离子为母离子，通过改变锥孔电压，选择准分子离子响应最好的电压作为锥孔电压；对准分子离子进行二级全扫描，得到其碎片离子信息；通过改变碰撞能量，选择稳定且响应最好的两个碎片离子作为特征子离子，其中丰度相对较强的为定量离子，另一个作为定性离子，再对两个碎片离子的碰撞能量进行优化，使定量离子和定性离子的响应最优。优化后得到的质谱参数见表2。

表2 麻辣烫空白样品中14种喹诺酮类药物的基质效应、回收率与精密度(n=6)

*quantitative ion

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择 麻辣烫样品的种类繁多，成分复杂，所以样品前处理过程中提取溶剂的选择尤为重要。有机溶剂中乙腈和甲醇对喹诺酮类化合物具有较好的提取效果，同时两种溶剂具有沉淀蛋白的作用；但由于甲醇极性大于乙腈，采用甲醇提取时，会提取出更多的极性杂质，增加了后续除杂难度，因此选择乙腈为提取溶剂。麻辣烫中的喹诺酮类药物应为人为添加，药物在样品中的存在形式以游离态为主，且该类化合物大多带有伯胺或仲胺基团，具有一定的弱碱性，因此考察了添加不同体积分数甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂的提取效果，实验表明，2%甲酸乙腈溶液作为提取溶剂时提取效率最优，因此最终选择其为最佳提取溶剂。

2.2.2 净化条件的优化 本研究采用2%甲酸乙腈溶液作为麻辣烫样品中喹诺酮类药物的提取液，因麻辣烫样品本身含水量较大，且乙腈和水互溶，因此本文采用氯化钠作为盐析剂，以缓解提取中的乳化现象，并将大量的水溶性杂质除去，减少质谱污染。

麻辣烫样品中含有的大量油脂会随着2%甲酸乙腈溶液一并提取出来，为了减少最终检测溶液中油脂的含量，需对提取液进行除油操作。考虑到常用除油试剂石油醚、乙醚较易挥发，所以选择乙腈饱和的正己烷进行除油。

选用Waters Oasis HLB 固相萃取柱进行后续净化，考察了淋洗液浓度和洗脱液体积，最终选择6 mL 5%甲醇溶液作为淋洗液，6 mL甲醇作为洗脱液。

2.2.3 基质效应的评价 基质效应是存在于样品前处理过程直至最终测试溶液中的干扰物在质谱中与目标化合物竞争电离，进而影响目标化合物的检测灵敏度和重现性的现象。本研究中，分别配制了相同含量的基质工作曲线和溶剂标准曲线，进样测试，得到两条标准曲线，通过计算同一目标化合物两条曲线的斜率比值，来评价各目标化合物基质效应的影响，结果见表2，其中奥比沙星呈现较为明显的基质抑制效应，为了得到更准确的定量结果，本研究中采用基质工作曲线。

2.2.4 线性方程、检出限与定量下限 按照“1.4”方法配制浓度为7.5，15，30，50，75，100 μg/L 6个浓度水平的混合基质工作溶液，并在优化的色谱-质谱条件下进行检测。以目标化合物定量离子的峰面积与内标物定量离子峰面积的比值(y)作为纵坐标、质量浓度(x，μg/L)为横坐标绘制曲线。结果显示，14种喹诺酮类药物在7.5～100 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r)为0.990 1～0.999 3。实验采用空白样品中添加混合目标组分的方法，按照前处理过程和仪器条件进行样品前处理和检测，以定量离子色谱峰信噪比(S/N)大于3作为检出限，S/N>10作为定量下限，确定麻辣烫中14种喹诺酮类药物的检出限均为0.5 μg/kg，定量下限均为1.5 μg/kg。

2.2.5 回收率与精密度 在空白麻辣烫样品中添加14种喹诺酮类药物的混合标准溶液，制备含量分别为1.5，3.0，15 μg/kg的加标样品，按照“1.3”处理方法及“1.5”和“1.6”的测定条件进行回收率实验，每个加标水平平行6份，结果见表2。各化合物的平均回收率为75.4%～110.0%，相对标准偏差为1.3%～10.1%。

图2 阳性样品的代表谱图Fig.2 Representative chromatograms of positive sampleA：chromatogram of ciprofloxacin's quantitative ion;B:chromatogram of deuterated ciprofloxacin's quantitative ion

2.3 实际样品的检测

采用本文建立的方法，对185批麻辣烫和15批麻辣烫底料食品进行检测，样品采自沈阳、大连、本溪、抚顺、铁岭、盘锦、鞍山、阜新、辽阳、营口各地，覆盖了以上各城市的麻辣烫店、烧烤店、饭店、小吃街和批发市场等，结果在麻辣烫底料中未检出本文的14种喹诺酮类化合物，有8批次麻辣烫中检出喹诺酮类药物，其中检出恩诺沙星为3.3 μg/kg，诺氟沙星2.6 μg/kg，环丙沙星分别为2.4,6.3,137,3.5,3.0,166,6.8 μg/kg。阳性样品的代表谱图见图2。

3 结 论

本研究采用酸化乙腈提取麻辣烫样品中的喹诺酮类化合物，结合固相萃取净化方法，建立了UPLC-MS/MS同时检测麻辣烫及底料中14种喹诺酮类药物的分析方法。该方法操作简便、快速、准确，其灵敏度、回收率和精密度均符合检测技术的要求，可为食品检验检测机构进行麻辣烫及其底料中的喹诺酮类药物检测提供技术支持。

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Determination of Quinolones in Hotpot Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Fei*,GAO Guang-hui,JIA Hong-xin

(Liaoning Institute for Food Control,Shenyang 110015,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was established for the determination of 14 quinolones in hotpot.Samples were extracted with acidified acetonitrile,defated withn-hexane,separated on a C18solid phase extraction(SPE) column,and analyzed by LC-ESI-MS/MS under the positive mode with multiple reaction monitoring(MRM).The method showed good linearities for 14 quinolones over the range of 7.5-100 μg/L with correlation coefficients(r) more than 0.990.The detection limits of 14 quinolones were 0.5 μg/kg,and the quantitation limits were 1.5 μg/kg.The recoveries of all analytes in hotpot ranged from 75.4% to 110.0%with relative standard deviations(RSD,n=6)of 1.3%-10.1%.The method has the advantages of simplicity,rapidness,good purifying effect and sensitivity,and is suitable for the simultaneous determination of quinolones in hotpot.

SPE;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);quinolones;hotpot

2017-01-22；

2017-02-15

国家质检总局科研计划项目(2016IK169)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.011

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)06-0768-05

*通讯作者：赵 飞，硕士，工程师，研究方向：理化分析，Tel：13940021647，E-mail：60340837@qq.com