基于肿瘤细胞膜纳米载药系统的构建及评价

夏洁，程宇豪，章杭，钱汉清，刘宝瑞

（1.南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心/南京大学临床肿瘤研究所，江苏南京210008；2.南京大学医学院医药生物技术国家重点实验室，江苏南京210029）

基于肿瘤细胞膜纳米载药系统的构建及评价

夏洁1，程宇豪2，章杭1，钱汉清1，刘宝瑞1

（1.南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心/南京大学临床肿瘤研究所，江苏南京210008；2.南京大学医学院医药生物技术国家重点实验室，江苏南京210029）

目的研究并明确肿瘤细胞膜纳米粒载药系统的体外应用价值。方法本实验设计并成功构建了一种新型肿瘤细胞膜纳米粒载药系统。该系统以肿瘤细胞膜为载体，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为内核，负载香豆素-6（Coumarin-6）作为荧光探针。在体外通过流式细胞仪及激光共聚焦成像分析并评价肿瘤细胞膜纳米粒（CNPs）及红细胞膜纳米粒（RNPs）、脂质体纳米粒（LNPs）在肿瘤细胞中的摄取差异。结果CNPs可粘附到肿瘤细胞表面，且肿瘤细胞对CNPs摄取最多。结论肿瘤细胞膜纳米粒载药系统在肿瘤靶向递药领域具有应用前景。

递药系统；肿瘤细胞膜；粘附；靶向

目前，对基于天然生物膜材料药物载体的研究得到较大关注。红细胞膜[1-2]、白细胞膜[3]、血小板膜[4-5]等均被应用于构建纳米载药系统，且在体内外均表现出各自所来源细胞的特性。例如红细胞膜纳米载药系统表现出长循环特性[1]、白细胞膜纳米载药系统体现了白细胞的炎症驱化特性[3]等。但在肿瘤靶向递药上，上述细胞膜载药系统均没有太大作为。红细胞膜载体虽实现了体内长循环，但对肿瘤病灶并未表现出明显的靶向性。白细胞载体仅表现出对炎症部位的靶向。而与此同时，肿瘤细胞因其较强的细胞粘附特性而被广泛研究[6-7]。肿瘤细胞膜上常高表达Ca2+依赖性蛋白[8-10]，介导肿瘤细胞膜之间的相互粘附及靶向。在体内，该粘附特性促使肿瘤细胞之间相互识别并粘附，抵抗失巢凋亡[11]；在体外，该粘附特性导致肿瘤细胞相互粘附并自组装成细胞球，成团生长[12]。因此，肿瘤细胞膜作为药物载体表现出较强的肿瘤靶向潜力。通过细胞裂解、梯度离心等一系列步骤，肿瘤细胞膜可被完好剥离，并保留有靶向粘附特性。当被用作纳米药物载体后，该载体系统便具有独特的靶向粘附能力。

本实验采用A549、Hela细胞膜作为肿瘤细胞膜载体，以负载香豆素-6的PLGA纳米粒作为内核，构建新型肿瘤细胞膜纳米粒（CNPs）的靶向输送系统。通过与红细胞膜纳米载药系统(RNPs)、脂质体纳米载药系统(LNPs)对比，评价CNPs体外靶向应用价值。实验表明，该新型生物膜载药系统在肿瘤细胞靶向性方面具有一定的优越性。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器PLGA（LA/GA=50:50）购自美国Lactel Absorbable Polymers公司，香豆素-6购自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG-2000）购自深圳艾维特科技有限公司；胆固醇及大豆卵磷脂购买自南京化学试剂公司；癌胚抗原（CEA）及β-肌动蛋白（β-actin）抗体购自英国Abcam公司；Mini蛋白酶抑制剂购买自瑞士罗氏公司；电泳试剂盒购买自南京凯基生物公司；RPMI-1640培养基购自文森特生物技术南京有限公司，小牛血清、胰蛋白酶购自杭州四季青生物公司；BCA蛋白检测试剂盒购自碧云天生物公司。

实验所用仪器为Beckman T40i超速离心机，Brookhaven 90Plus粒径仪，Olympus FV10i激光共聚焦显微镜，BD FACSCalibur流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及准备人宫颈癌Hela细胞、人肺癌A549细胞购自美国模式菌种收集中心。细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2全湿度培养。待细胞汇合度达80%～90%，使用含2mm乙二胺四乙酸（EDAT）的PBS溶液消化。消化的细胞经1 000 rpm×3min离心沉淀及1×PBS溶液洗涤3遍后，4瓶细胞沉淀收集备用。

1.2.2 肿瘤细胞膜提取将上述肿瘤细胞分散于2mL含有蛋白酶抑制剂的10%蔗糖低渗液。冰中静置30min，使用高速分散仪（100 000 rpm×3 min）搅拌、匀浆。匀浆液经1 500 rpm×5min离心后，收集上清液。剩余沉淀重复上述步骤5～6次后，收集所有细胞裂解液并保存冰上。

将上述细胞裂解液用蔗糖溶液（55%wt,40%wt,30%wt）进行超速梯度离心（28 000 g×30min）。收集30%～40%界面组分，并以28 000 g离心10min收集沉淀。将沉淀用去离子水洗涤2次即得到提取的肿瘤细胞膜。

1.2.3 红细胞膜的提取取人血3mL离心，去除血浆。得到的红细胞用1×PBS洗涤3次后，分散于0.25×PBS中，并于冰中静置裂解2 h。裂解液经10 000 g离心10min后，用1×PBS洗涤3次即得到红细胞膜。

1.2.4 脂质体的制备取胆固醇6.42mg、卵磷脂36.9mg、DSPE-PEG-2000 5.7mg溶解在二氯甲烷中。真空旋干后，加入3mL纯水水化。后在冰水中超声(500W,5min)，即得到脂质体。

1.2.5 PLGA纳米粒的制备10mg PLGA与0.05%wt的香豆素-6共同溶于2mL丙酮，并逐渐滴加在6mL去离子水中。常温下搅拌1 h，抽真空搅拌3 h以充分去除丙酮。最后得到香豆素标记的PLGA纳米粒子。

1.2.6 膜纳米粒的制备将肿瘤细胞膜用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。取等量负载香豆素-6的PLGA与肿瘤细胞膜溶液充分混匀。并使用脂质体挤出仪，依次挤过400 nm和200 nm的膜，最后即得到肿瘤细胞膜包裹PLGA的纳米粒子（CNPs）。采用同样方法制备红细胞膜纳米粒子(RNPs)及脂质体纳米粒子(LNPs)。

1.2.7 纳米粒子的表征

（1）平均粒径、表面电荷：纳米粒子粒径及表面电荷利用Brookhaven 90Plus粒径仪测定，测试条件为：室温，1mg/mL样品1.25～1.8mL。

（2）形貌评价：采用透射电子显微镜观察纳米粒子的形貌。将覆有支持膜的铜网置于CNPs中反复捞3次，吸水纸吸去多余水分。自然干燥后，在Olympus FV10激光共聚焦显微镜上观察。

1.2.8 SDS-PAGE电泳及Western blot分析将A549细胞裂解物及A549细胞膜提取物浓度均稀释成1mg/mL。取适量样品加入上样缓冲液，100℃沸水中煮沸10min。分别添加20μL样品在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品槽内。通电分离蛋白组分。使用SimplyBlue对凝胶进行染色，并在水中脱色过夜。

凝胶上蛋白转至聚偏氟乙烯膜上。使用CEA抗体、Beta-actin抗体作为一抗与膜在4℃共孵育过夜。洗涤3遍后与二抗在室温下共孵育1 h。再洗涤3遍。通过Tanon 4200化学发光成像系统对聚偏氟乙烯膜进行拍照采集数据。

1.2.9 流式分析2×106个A549细胞及Hela细胞分别接种在六孔板中，镜下观察细胞生长汇合度在80%左右，使用无血清培养基洗涤3遍。将香豆素-6标记的A549细胞膜纳米粒（ANPs）、Hela细胞膜纳米粒（HNPs）及LNPs按照PLGA的浓度均稀释为1mg/mL，并每孔300μL依次加入6孔板内，置于培养箱共培养2 h。弃去培养基后，依次用无血清培养基和1×PBS洗涤，加入0.5mL胰酶消化。收集细胞，1000 rpm× 3min离心沉淀，并用1mL 1 640培养基重悬。使用BD FACSCal ibur流式细胞仪对样品进行数据采集。

1.2.10 激光共聚焦成像1×105个A549细胞及Hela细胞分别接种在24孔板中，镜下观察细胞汇合度在60%左右后，使用无血清培养基洗涤3遍。150μL、1mg/mL ANPs、HNPs、RNPs、LNPs分别依次加入24孔板中。置于培养箱中共培养2 h。吸去培养基后，1×PBS洗涤1遍，加入4%的多聚甲醛溶液500μL固定10 min。1×PBS洗涤1遍后，加入hoechst33342染料染色10min。1×PBS再洗涤3遍。通过Olympus FV10i激光共聚焦显微镜观察细胞对纳米粒子的摄取。

2 结果

2.1 CNPs的表征粒径仪检测结果显示，PLGA内核的粒径为（117.00±0.23）nm，提取的肿瘤细胞膜载体的粒径为（330.00±0.82）nm，CNPs的粒径为（141.00±0.19）nm（见图1A）。电势检测表明，PLGA内核的电势（-37.0±0.6）mV，CNPs的电势（-20.00±0.53）mV，与肿瘤细胞膜载体的电势（-21.7±0.9）mV相近（见图1B）。证明肿瘤细胞膜已成功地包裹在PLGA的外表面。透射电镜较直观地展现出CNPs的“壳核”结构（见图1C），也证明了PLGA粒子已被肿瘤细胞膜成功包被。此外，通过透射电镜也可看到，膜结构几乎存在于所有的纳米粒子外表面，所制备的CNPs的粒径均一性及粒子分散性均较好。

为明确肿瘤细胞膜上蛋白保留情况，实验中将肿瘤细胞裂解液及所提取TCM同时做凝胶电泳分析。见图2，肿瘤细胞裂解液与TCM共有一些条带。但与细胞裂解液相比，TCM缺失部分条带。进一步做Western blot分析发现，作为细胞膜蛋白表达指标的CEA成分共同存在于二者之上。证明实验所提取的确为肿瘤细胞膜，并且保留有膜上蛋白。但是，细胞骨架蛋白Beta-actin作为细胞质蛋白指标，较多存在于肿瘤细胞裂解液的条带上，细胞膜提取物所含较少。因此表明，通过低渗裂解并梯度离心后，肿瘤细胞质成分被基本去除，而肿瘤细胞膜上蛋白仍继续保留在膜表面。见图3。

2.2 CNPs对肿瘤细胞具有较强靶向性为明确CNPs对肿瘤细胞的靶向性，我们设计多种香豆素-6标记的CNPs，包括A549膜纳米粒子（ANPs），Hela细胞膜纳米粒子（HNPs）以及红细胞膜纳米粒子（RNPs）,脂质体纳米粒子（LNPs）,通过观察A549、Hela细胞对上述粒子的摄取，评价CNPs在肿瘤细胞中的靶向性。

将上述粒子分别与Hela、A549细胞共孵育2h后，通过流式细胞分析数据显示：Hela及A549细胞中添加HNPs及ANPs的4组实验组均表现出较高的荧光强度。但HNPs与ANPs荧光强度之间并未表现出明显的差异。LNPs组在两种肿瘤细胞中的荧光强度均较弱，仅强于空白细胞对照组。结果表明，Hela细胞及A549细胞均对CNPs具有更高的摄取率。见图4。

图1 CNPs的表征:粒径(A)、表面电势(B)、透射电镜(C)Figure1 The characteristic of CNPs,including size(A),surface charge(B),transmission electronmicroscopy imaging(C)

图2 细胞裂解物及细胞膜提取物的SDS-PAGE分析Figure2 The SDS-PAGE analysisofboth cell lysatesand cell membraneextraction

图3 细胞裂解物及细胞膜提取物的Western Blot分析Figure3Thewestern blotanalysisofboth cell lysatesand cell membraneextraction

图4 流式细胞分析反映肿瘤细胞对纳米粒子的摄取Figure 4 Theuptake differencesof nanoparticlesby cancer cellswere reflected by flow cytometry analysis

本研究进一步利用激光共聚焦显微镜观察了肿瘤细胞对纳米粒的摄取情况，见图5A：CNPs组的肿瘤细胞内表现出较强的绿色荧光，RNPs组相对荧光较弱，LNPs实验组则几乎无荧光。使用imangJ软件对荧光量进行分析，通过计算视野中绿色荧光与细胞个数的比值，反映出各个组之间的荧光差异，见图5B：CNPs组的荧光量均高于RNPs组，LNPs组最弱。该结果进一步说明肿瘤细胞对CNPs有更高的亲和力。CNPs在肿瘤细胞中的摄取强于RNPs及LNPS。

2.3 CNPs对肿瘤细胞具有粘附性为进一步探讨CNPs与肿瘤细胞之间高亲和力的原因，本实验使用激光共聚焦显微镜对Hela细胞的四个实验组进行进一步成像分析。通过随机选取细胞视野并放大拍摄倍率，观察CNPs与肿瘤细胞之间相互关系；见图5C：HNPs及ANPs组均可看到明显的绿色荧光环绕在Hela细胞表面，同时Hela细胞内部也散在绿色荧光；RNPs组中，Hela细胞外表面及细胞内部绿色荧光均较弱；LNPs组中，Hela细胞外表面几乎无绿色荧光，仅细胞内部散在少许微弱荧光。结果表明，CNPs可粘附在肿瘤细胞表面，RNPs较少粘附在肿瘤细胞表面，LNPs几乎无粘附作用。此外，肿瘤细胞对粒子的吞噬量与各粒子的细胞粘附性成正比，肿瘤细胞对CNPs摄取最多。

3 讨论

肿瘤细胞膜因其天然的粘附能力可以被应用于药物递送领域。肿瘤细胞膜上表达多种细胞粘附分子，通过同质或异质粘附作用，促使肿瘤细胞膜粘附在一起[13-15]。这种粘附特性使得利用肿瘤细胞膜构建的药物载体，在肿瘤靶向药物递送上具有较好的前景[16]。使用肿瘤细胞膜负载纳米药物，可增强纳米载药系统的主动靶向性[10,17]，提高药物投递效率。相较于RNPs及LNPs对肿瘤细胞的低亲和力，CNPs便可因其独特的粘附特性更好的锚定到肿瘤病灶。通过本实验证明，CNPs可靶向粘附到肿瘤细胞表面，并且肿瘤细胞确对CNPs有更多的摄取，优于RNPs及LNPs。

图5 肿瘤细胞对纳米粒子的摄取差异（A、B）及粘附程度（C）Figure5 Tumor celluptakeof nanoparticles(A,B)and adhesion(C)

因此，当肿瘤细胞膜载体应用到纳米载药系统后，一方面，肿瘤细胞膜载体可以携带负载药物靶向投递，实现低药物副作用、高药物杀伤效率；另一方面，因其较强的粘附作用，肿瘤细胞膜载体可粘附到游离肿瘤细胞表面，并投递负载药物，实现杀伤，减少肿瘤血行播散的机会。但是，肿瘤细胞膜载体仍有许多问题亟待解决：一是肿瘤细胞膜的抗原免疫性未被验证。肿瘤细胞膜上表达多种特异性抗原，能激活淋巴系统，产生特异性及非特异性细胞免疫。外源性肿瘤细胞膜纳米粒的体内注射可能会引起一系列免疫不良反应。然而，使用内源性肿瘤细胞膜载体面临着获取困难，获取量少的问题。二是肿瘤细胞膜提取的纯净度仍需提高。肿瘤细胞膜在提取过程中，不可避免的混杂有DNA或RNA片段及活性蛋白质，具有安全风险，因此在制备过程中仍需继续完善工艺。

目前肿瘤细胞膜纳载体的研究仍然处于起步阶段，未来更多更深入的研究仍需进一步推进。

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Preparation and application assessmenton drug delivery system of cancer cellmembrane coated nanoparticles

Xia Jie1,Cheng Yu-hao2,Zhang Hang1,Qian Han-qing1，Liu Bao-rui1
（1.The Comprehensive Cancer Centerof Drum Tower Hospital,Medical Schoolof Nanjing University and ClinicalCancer Instituteof Nanjing University,Nanjing,Jiangsu,210008,China；2.State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology,Nanjing University,Nanjing,Jiangsu, 210093，China）

Objective For investigating and assessing theapplication of cancer cellmembrane coated nanoparticles(CNPs).Methods In this research,we designed a innovative nanoparticlew ith cancer cellmembrane coating and coumarin-6 labled PLGA core.We evaluated the uptake between CNPsand non-CNPs(including red blood cellmembrane coated nanoparticlesand liposome nanoparticles)of cancer cells in vitro,by flow cytometry analysis and fluorescently confocal imaging.Resu lts Through data analysis,we found that CNPs could specially adhere to the surface of cancer cells,and were swallowedmore than others by cancer cells.Conclusion CNPshave a prom ising application prospective in tumor-targeted drug delivery.

Drug delivery system;Cancer cellmembrane;Adhesion;Targeting

国家自然科学基金青年科学基金项目(81602106)

钱汉清，E-mail：qianhanqing1986@126.com；刘宝瑞，E-mail:baoruiliu@nju.edu.cn