不同提取方法对牛乳脂肪分析的影响

杨昕艳

（秦皇岛金海特种食用油工业有限公司，河北秦皇岛066000）

不同提取方法对牛乳脂肪分析的影响

杨昕艳

（秦皇岛金海特种食用油工业有限公司，河北秦皇岛066000）

分别采用石油醚-乙醚溶剂系统和氯仿-甲醇溶剂系统，并结合冻干后提取和液液萃取等方法，对牛乳乳脂的总脂肪酸和乳脂脂肪sn-2脂肪酸的组成进行分析。结果表明，在分析乳脂的脂肪酸组成方面，氯仿-甲醇溶剂系统比石油醚-乙醚溶剂系统具有更好的提取效果，尤其对于长链脂肪酸和不饱和脂肪酸；液液萃取比冻干后提取具有更好的平行性和稳定性。

乳脂肪；脂肪酸；sn-2脂肪酸；分析；提取方法

脂肪的提取，通常涉及到溶剂的选择性萃取和被提取对象在脂肪提取之前的处理。脂肪的溶解性是脂肪提取的一个重要标准，其在很大程度上取决于样品中脂肪的存在类型和非极性脂肪（主要是甘油三酯）与极性脂肪（主要是磷脂和糖脂）所占的比例[1]。因此，可以根据样品类型及其组成成分的特点，选择不同的溶剂系统来提取脂肪组分。

此外，为了从样品中提取出脂肪，往往需要对样品进行前处理，以方便脂肪的提取，如干燥、减小样品的粒径、破坏包被脂肪的成分等。就乳脂肪来说，在脂肪提取之前需要使用氨水对乳样进行处理，以溶解酪蛋白，使乳脂肪从包被的基质（乳脂肪球膜、酪蛋白胶束）中释放出来[2-3]。此外，有时还需要对样品进行预干燥，以便更高效、更完全地提取脂肪。

脂肪的类型、脂肪酸组成、脂肪结构的组成、脂类物质的氧化状况等的分析，都需要将脂肪从所处的基质中分离出来。就脂肪的脂肪酸组成来说，不仅需要了解总脂肪的脂肪酸组成，也需要了解这些脂肪酸在脂肪结构中所处的位置，如sn-2脂肪酸组成等。

脂肪提取的结果将直接影响脂肪各个属性的分析。鉴于此，试验对氯仿-甲醇和石油醚-乙醚2个溶剂系统分别在冻干后提取和液液萃取时，对提取总脂肪的脂肪酸和脂肪结构中sn-2脂肪酸的影响进行了对比。

1 试验方法

1.1 石油醚-乙醚冻干提取

称取25 g样品，进行冷冻干燥。冻干后的样品加入25 mL乙醇和100 mL石油醚-乙醚（1∶1，V/V）并搅拌均匀（500 r/min，10 min，室温），然后静置待溶液澄清，分离出上清液；重复提取5次后，将所有上清液以转速4 000 r/min离心3 min，再将上清液于40℃，100 r/min旋转蒸发去除溶剂；将所得乳脂贮藏于-18℃备用。

1.2 石油醚-乙醚液液萃取

称取25 g样品，加入5 mL氨水和25 mL无水乙醇并摇匀；加入62.5 mL无水乙醚和62.5 mL石油醚，混合均匀后静置分层，下层液体用75 mL石油醚-乙醚（1∶1，V/V）重复萃取5次；将所有上清液合并，于40℃，100 r/min条件下旋转蒸发去除溶剂；将所得乳脂贮藏于-18℃备用。

1.3 氯仿-甲醇液液萃取

称取10 g样品，加入2 mL浓氨水，振荡摇匀后加入30 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）和适量NaCl，再次振荡摇匀；以转速6 000 r/min离心5 min，上层液体重复提取2次；合并所有提取的下层清液，加入适量超纯水并振荡摇匀，离心后用旋转蒸发仪蒸干溶剂；将所得乳脂贮藏于-18℃备用。

1.4 氯仿-甲醇冻干提取

称取10 g样品，加入2 mL浓氨水并振荡摇匀1 min；将样品进行冷冻干燥，在冻干后样品中加入30 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）和少许NaCl，振荡摇匀；以转速6 000 r/min离心5 min，取出下层清液后再次加入氯仿-甲醇溶液重复提取2次；合并所有提取液，后续处理方法同氯仿-甲醇液液萃取。

1.5 乳脂脂肪酸组成分析

称取0.3 g乳脂于15 mL样品瓶中，加入5 mL正己烷和0.5 mol/mL的KOH-CH3OH溶液3 mL；加盖混匀后置于60℃烘箱加热0.5 h，取出后立即以转速4 500 r/min离心5 min后，取上清液用Agilent 7820型GC进行分析。气相色谱升温程序：140℃保持5 min，以10℃/min升温至180℃并保持10 min，以2℃/min升温至210℃并保持10 min，最后以10℃/min升温至230℃并保持15 min。气相色谱柱Agilent CP-SIL88型（100 m×0.25 mm×0.2 μm），37种脂肪酸甲酯（Supelco，CRM47885 LC08286V）。

1.6 乳脂sn-2脂肪酸组成分析

（1）样品处理。取约0.1 g样品在15 mL离心管中，加入200 μL正己烷使样品完全溶解；称取0.02 g猪胰脂肪酶，加入2 mL的Tris缓冲溶液轻轻摇动，加入500 μL胆酸钠，200 μL饱和CaCl2溶液，在40℃水浴锅中振摇2 min；然后于室温下手摇1 min，立即加入1 mL盐酸及1 mL无水乙醚，剧烈摇匀；以转速4 500 r/min离心3 min，静置1 min；将上清液加入1支干净的15 mL离心管中，加入无水硫酸钠摇匀。

（2）TLC分离。取一块100 mm×200 mm硅胶板（青岛海洋化工GF254），用展开剂（正己烷∶无水乙醚∶乙酸乙酯∶甲酸=60∶38∶2∶1）进行分离；在256 nm的紫外灯下荧光显色，刮下目标区域，装入15 mL离心管中；离心管中加1 mL正己烷和1 mL BF3-甲醇溶液，放入60～70℃烘箱中酯化30 min，以转速4 500 r/min离心，取上层清液检测。

检测方法如乳脂的脂肪酸组成分析所述。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂系统和提取方法分析的乳脂脂肪酸组成差异

不同溶剂系统和提取方法对乳脂脂肪酸组成的分析结果见表1。

表1 不同溶剂系统和提取方法对乳脂脂肪酸组成的分析结果

对于石油醚-乙醚溶剂系统来说，无论是冻干提取还是液液萃取，二者提取的乳脂脂肪酸组成具有接近的脂肪酸组成，说明2种提取方法的准确性较好。在测量数据平行性方面，除了饱和脂肪酸C14∶0和C16∶0含量在液液萃取条件下的波动大于冻干提取方法外，其余各种类型脂肪酸测定的平行性方面液液萃取方法优于冻干提取方法（具有较小的标准差）。

对于氯仿-甲醇溶剂系统来说，冻干提取方法得到的结果平行性和稳定性明显比液液萃取方法的差，冻干提取的标准差曲线波动特别大，有些甚至超过9%。

氯仿-甲醇溶剂系统液液萃取与石油醚-乙醚溶剂系统相比而言，其分析结果也比较接近，同时也具有较好的数据平行性，但二者没有显著的差异性。

2.2 不同溶剂系统和提取方法分析的乳脂sn-2脂肪酸组成差异

不同溶剂系统和提取方法对乳脂sn-2脂肪酸组成的分析结果见表2。

表2 不同溶剂系统和提取方法对乳脂sn-2脂肪酸组成的分析结果

由表2可知，试验中的同一溶剂系统无论采用冻干提取还是液液萃取，方法之间的差异性很小，结果极为接近，并且这些方法检测结果的重现性也较好，标准差都较低。对于不同溶剂系统，氯仿-甲醇溶剂系统平行样本间的标准差基本在0.7以内，显示出良好的稳定性和重现性。同时，氯仿-甲醇溶剂系统进行液液萃取方法获得的检测结果平行性和稳定性也更优于冻干方法的结果；石油醚-乙醚溶剂系统中冻干提取方法和液液萃取方法的标准差基本在0.5以上，波动最大的在2左右。因此，氯仿-甲醇溶剂系统的效果更优于石油醚-乙醚溶剂系统对乳脂sn-2脂肪酸的分析。

对于中短链脂肪酸（C8∶0，C10∶0，C12∶0，C14∶0），不同溶剂系统和提取方法之间都有较好的提取效果；而对于长链脂肪酸和不饱和脂肪酸（C16∶0，C18∶1，C18∶0），氯仿-甲醇溶剂系统明显优于石油醚-乙醚系统。由表2可知，氯仿-甲醇溶剂系统提取到不饱和脂肪酸C18∶1的相对百分含量大于石油醚-乙醚溶剂系统。因为在乳脂脂肪的sn-2位置，不饱和脂肪酸含量相对较少，因此石油醚-乙醚溶剂系统带来的结果误差大于氯仿-甲醇溶剂系统的结果误差。对于不同乳脂来说，尤其是骆驼乳、人乳等，长链脂肪酸和不饱和脂肪酸含量较多的乳类，氯仿-甲醇溶剂系统比石油醚-乙醚溶剂系统具有更好的提取效果。

3 结语

作为脂肪提取常用的溶剂系统，其对总脂肪的提取都具有良好的效果，均在脂肪的分析中得到广泛应用。在试验中，2种溶剂系统对总脂肪酸的分析结果相近，没有显著性差异，说明这2种溶剂系统都比较适合总脂肪酸组成的分析。然而，对于脂肪结构sn-2位脂肪酸组成的分析中，2种溶剂系统表现出了明显的不同，氯仿-甲醇溶剂系统比石油醚-乙醚溶剂系统在sn-2位脂肪酸分析中具有更好的效果。同时，氯仿-甲醇溶剂系统以液液萃取分析sn-2位脂肪酸结果也比以冻干后分析sn-2位脂肪酸具有更好的平行性和稳定性。

[1]商允鹏，生庆海，王贞瑜，等.三酰甘油sn-2位上棕榈酸生理功能及研究概况[J].中国粮油学报，2010（10）：119-123.

[2]袁小武，邓泽元，李静，等.胰脂肪酶法测定食用油甘油三酯中脂肪酸的位置分布[J].食品科学，2008（11）：544-547.

[3]朱启思，唐家毅，周珞，等.猪油酸解制备人乳脂替代品的研究[J].中国油脂，2009（2）：39-42.◇

Analysis and Evaluation on Fatty Acids and sn-2 Fatty Acids in Commercial Infant Formula

YANG Xinyan
（Qinhuangdao Goldensea Speciality Oils&Fats Industries Co.，Ltd.，Qinhuangdao，Hebei 066000，China）

The total fat and the compositon of cholesterol fat sn-2 fatty acid are analyzed by petroleum ether-ether solvent system and chloroform-methanol solvent system respectively，and the effects of freeze-drying and direct liquid-liquid extraction are studied.The results show that the chloroform-methanol solvent system had better extraction effect than petroleum ether-ether solvent system in the analysis of fatty acid compositon of milk fat.Especially for long-chain fatty acids and unsaturated fatty acids；liquid-liquid extraction is better than freeze-drying the result of parallelism and stability.

milk fat；fatty acids；sn-2 fatty acids；analysis；extraction method

TS816.5

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.032

1671-9646（2017）05b-0015-03

2017-05-26

杨昕艳（1980—），女，本科，工程师，研究方向为食品科学、油脂化学和乳品科学。