miR-182在胆囊癌中的表达及其对胆囊癌细胞增殖、侵袭能力的影响

张智勇,郑 伟,常虎林,杜立学,刘 阳

1.陕西省人民医院肝胆外科(西安710068),2.西安交通大学第二附属医院普外科(西安710004)

miR-182在胆囊癌中的表达及其对胆囊癌细胞增殖、侵袭能力的影响

张智勇1,郑 伟1,常虎林1,杜立学1,刘 阳2△

1.陕西省人民医院肝胆外科(西安710068),2.西安交通大学第二附属医院普外科(西安710004)

目的：检测miR-182在胆囊癌中的表达，探讨其影响胆囊癌细胞增殖、侵袭的可能机制。方法：实时荧光定量 PCR检测miR-182、p38在10例胆囊癌组织、癌旁组织中的表达情况；应用miR-182 mimics转染胆囊癌细胞GBC-SD，应用p38 MAPK信号通路特异性阻滞剂SB203580处理转染miR-182 mimics的GBC-SD细胞，通过MTT实验、细胞周期检测、Transwell小室检测miR-182对GBC-SD细胞增殖、侵袭能力的影响。结果：胆囊癌组织中miR-182、p38的表达高于癌旁组织；miR-182 mimics转染GBC-SD细胞后，p38的表达水平随之升高(P<0.05)，细胞增殖能力增强，细胞迁移数增多(75±8)，S期细胞比例增多[(68.81±7.57)%]；应用SB203580处理转染miR-182的GBC-SD细胞，细胞增殖能力降低，细胞迁移数减少(23±5)，S期细胞比例减少[(34.49±7.05)%]。结论：miR-182 在胆囊癌组织中高表达，通过上调p38 MAPK信号通路增强胆囊癌细胞的增殖、侵袭能力，参与了胆囊癌的发生发展过程。

胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，发病隐匿，是侵袭性和致死性较高的恶性肿瘤之一，由于肿瘤早期极易侵犯肝脏或通过淋巴结发生转移，因此手术切除率较低，文献报道外科手术切除后5年存活率约为5%[1]，因此，研究胆囊癌的发生发展机制对改善患者预后有着重要的意义。microRNA(miRNA)是一类约18～25个碱基组成的非编码单链RNA，转录后参与肿瘤的发生发展[2]。miR-182定位于人7号染色体(7q32.2)，大量研究报道miR-182与胃癌、结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤的发生发展有关[3]。本研究旨在探讨miR-182在胆囊癌组织与癌旁组织中的表达差异，并通过细胞实验探讨miR-182影响胆囊癌细胞GBC-SD增殖、侵袭的可能机制。

材料与方法

1 材 料 选取2013年1月至2014年6月陕西省人民医院肝胆外科收治的10例胆囊癌患者，癌组织标本均为手术切除并经过病理证实，切除距癌灶边缘2～5 cm的组织作为癌旁组织；胆囊癌细胞GBC-SD，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。主要试剂：p38 MAPK信号通路特异性阻滞剂SB203580，购自美国Selleck公司；miR-182、p38、β-actin引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；miR-182 mimics、miRNA阴性对照，购自广州锐博生物科技有限公司；胎牛血清、Trizol试剂，购自美国Amresco公司；LipofectamineTM2000、Opti-MEM，购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq实时定量PCR试剂盒，购自北京中山生物工程公司；Transwell小室，购自美国Corning公司。

2 实验方法 ①实时荧光定量PCR检测胆囊癌组织、癌旁组织中miR-182、p38 mRNA的表达：按照Trizol试剂说明书提取胆囊癌组织、癌旁组织的总RNA，取1μl RNA 溶液，用无RNA酶的水10倍稀释，取2 μl稀释后的RNA溶液，在波长260 nm和280 nm处测定光密度(OD)值，估计RNA 纯度，A260/A280 比值在1.8～2.0之间则满足实时荧光定量PCR实验要求。配制逆转录反应体系：总RNA 500 ng，特异性逆转录引物0.5 μl，10 mmol/L的dNTP mix 0.5 μl，5×ExScriptTMBuffer 2 μl，RNase inhibitor 0.25 μl,ExScriptTMRtase 0.25 μl，加无RNA酶水至10 μl，反应体系的配制在冰上进行。将反应体系混匀后进行逆转录反应,反应条件：42 ℃,15 min；95 ℃,2 min。将所得的cDNA模板2 μl与上游引物1μl、下游引物1μl、SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl混匀，用ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件：95 ℃预变性2 min后；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s,总计40个循环。根据公式 Folds=2-△△Ct来计算目的基因的相对表达量。②miR-182转染胆囊癌细胞GBC-SD：选取对数生长期的GBC-SD细胞胰酶消化后接种到6孔板(1×105/孔)，24 h后细胞融合率达到30%～50%后弃去培养液，使用LipofectamineTM2000进行转染，转染试剂配制：将1 μl 的LipofectamineTM2000与50 μl轻轻混匀，室温孵育5 min；将miR-182 mimics(20 pmol)、miRNA阴性对照分别溶于Opti-MEM使其终浓度为20 μmol/L，室温孵育5 min；将miR-182 mimics、miRNA阴性对照分别与LipofectamineTM2000混匀，室温放置20 min，加入到含有GBC-SD细胞的6孔板中，并置于培养箱孵育24 h，实时荧光定量 PCR检测转染前后GBC-SD细胞中miR-182、p38 mRNA的表达。③MTT实验：将转染miR-182、miRNA阴性对照的GBC-SD细胞以1×105/孔的浓度接种于96孔板，分为转染组、阴性对照组，另设空白对照组，每组设3个复孔。分别于转染0、24、48、72、96 h后弃去培养液，加入20 μl的MTT试剂，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h后，每孔加入150 μl的 DMSO溶解，小心振荡10 min，在酶联免疫检测仪490 nm波长处测定每孔OD值；另取一组转染miR-182的GBC-SD细胞，加入SB203580，使其终浓度为75 μmol/L，设为SB203580组，实验过程同转染组。计算各组的细胞抑制率，细胞抑制率(%)=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。④细胞周期检测：将GBC-SD细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，将miR-182、miRNA阴性对照转染GBC-SD细胞，胰酶消化后，800 r/min离心5 min后弃去上清液，加入10 μl的Annexin Ⅳ-FITC和5 μl的PI，避光室温反应10～15 min，加入300 μl结合缓冲液后上流式细胞仪检测。另设空白对照组、SB203580组(75 μmol/L)，细胞周期检测过程同转染组。实验重复3次。⑤侵袭实验：GBC-SD细胞转染24 h后，胰酶消化，DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，上室加细胞悬液100 μl，下室加含1%胎牛血清的DMEM培养基400 μl，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，弃培养液，95%乙醇固定20 min，0.1%结晶紫浸染30 min，显微镜下计数迁移至Transwell小室下层的细胞个数，另设空白对照组、阴性对照组、SB203580组(75 μmol/L)，实验过程同转染组，每组实验重复3次。

结 果

1 胆囊癌组织、癌旁组织中miR-182、p38 mRNA的表达情况 见图1。实时荧光定量PCR结果显示，胆囊癌组织中miR-182mRNA的表达高于癌旁组织(P<0.05)，p38 mRNA在胆囊癌组织中的表达亦高于癌旁组织(P<0.05)。

* P<0.05

2 miR-182对胆囊癌细胞GBC-SD侵袭能力的影响 miR-182转染胆囊癌细胞GBC-SD后，miR-182(5.31±0.62)、p38(3.48±0.44)的表达较阴性对照组、空白对照组表达升高(P<0.05)(图2)，表明miR-182已成功转染至GBC-SD细胞中，miR-182上调了p38的表达。转染组GBC-SD细胞迁移数(75±8)高于阴性对照组(25±5)和空白对照组(30±6)(P<0.05)；SB203580组GBC-SD细胞的迁移数(23±5)，与转染组细胞迁移数的差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

* P<0.05

* P<0.05

3 miR-182对胆囊癌细胞GBC-SD增殖的影响 miR-182转染后促进GBC-SD细胞的增殖，与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，SB203580抑制miR-182对GBC-SD细胞的促增殖作用(图4)。细胞周期检测结果显示miR-182增加GBC-SD细胞S期百分比[(68.81±7.57)%]，与阴性对照组[(14.55%±3.06)%]、空白对照组[(20.03%±2.81)%]、SB203580组[(34.49%±7.05)%]比较差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。

转染组与阴性对照组比较，*P<0.05；转染组与SB203580组比较, #P<0.05

*P<0.05

讨 论

胆囊癌患者就诊时已存在不同程度的毗邻脏器浸润或转移，由于肿瘤的高度侵袭性，仅凭手术难以改善患者的远期疗效[4]，寻找特异性的诊断和治疗靶点是胆囊癌的研究热点。多数肿瘤中均可检测到miRNA的异常表达，通过转录后水平调控基因的表达，起“癌基因”或“抑癌基因”样作用调控肿瘤的发生发展[5]。Lagos-Quintana等[6]首次在小鼠的眼中发现了miR-182，随后有大量的研究发现miR-182在胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肝癌中发挥着类似癌基因的作用[3]。袁源[7]发现miR-182在胆囊癌组织中表达上调，但其在胆囊癌发生发展中的具体机制不详，我们的研究也发现了miR-182在胆囊癌组织、癌旁组织中的差异表达，miR-182在胆囊癌组织中的高表达参与了胆囊癌发生发展的调控过程。

p38 MAPK信号通路是MAPKs超家族4条平行通路之一，作用于细胞周期的各个检验点，参与调控细胞增殖过程[8]。文献报道p38 MAPK在多种肿瘤组织中持续高表达[9]，我们的研究也发现了p38在胆囊癌组织中高表达，通过miR-182转染胆囊癌细胞GBC-SD后，p38呈高表达水平，细胞的增殖、侵袭能力也增强，S期细胞所占比例增多，使用p38 MAPK信号通路特异性阻滞剂SB203580后，细胞的增殖、侵袭能力也随之降低，表明了miR-182可能通过上调p38 MAPK信号通路参与胆囊癌发生发展的调控。

miR-182类似癌基因样作用多见于乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌，Chen等[10]检测109例胰腺癌患者血清中循环型miR-182的表达，发现肿瘤患者循环型miR-182的表达高于胰腺炎、正常对照患者，诊断的敏感性和特异性均高于CA19-9，Kaplan-Meier生存曲线分析亦提示miR-182与患者预后明显相关。本实验仅检测了胆囊癌组织中miR-182的表达，未检测循环型miR-182的表达，临床样本量只有10例，因此未分析患者预后与miR-182表达水平的相关性。刘慧等[11]检测了86例直肠癌组织中miR-182的表达，发现miR-182的表达水平与肿瘤浸润、转移和分期显著相关，结果提示miR-182与肿瘤转移有关。我们的研究也发现，利用脂质体转染miR-182后GBC-SD细胞的侵袭能力增强，而这种增殖、侵袭能力的增强与p38 MAPK信号通路有关。然而，miR-182的表达与胆囊癌临床病理特征、预后是否相关有待于进一步的研究发现，也有文献报道miR-182通过抑制肿瘤转移抑制基因1的表达，促进肿瘤转移[12]。现有对miR-182靶基因的研究大多建立在miR-182与靶基因3'UTR互补配对，最新的关于miRNA探索领域是ceRNA调控网络假说[13]，而miR-182及其基因簇在ceRNA调控网络中的确切机制仍有待进一步加以探索。

本研究发现miR-182在胆囊癌组织中高表达，miR-182转染胆囊癌细胞GBC-SD 后细胞的增殖、侵袭能力增强，其分子机制可能是通过上调p38 MAPK信号通路实现的，miR-182调控胆囊癌发生发展的具体机制仍有待进一步研究。

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(收稿：2016-12-01)

The expression of miR-182 in gallbladder carcinoma and its effect on cell proliferation and migration of GBC-SD cells

Zhang Zhiyong,Zheng Wei,Chang Hulin,et al.

Department of Hepatobiliary Surgery, Shaanxi Provincial People’s Hospital (Xi’an 710068)

Objective: To detect the expression of miR-182 in gallbladder carcinoma, and explore its effect on cell proliferation and migration of GBC-SD cells in vitro. Methods: The expressions of miR-182, p38 in 10 pairs of gallbladder carcinoma and pericarcinomatous tissues were detected by Real-time PCR; the cell proliferation and migration of GBC-SD cells, which were transiently transfected with miR-182 mimics, and treated by p38 MAPK signaling pathway blocker SB203580, were tested by MTT, cell cycle analysis and Transwell chamber. Results: The expressions of miR-182, p38 were significantly higher in gallbladder carcinoma tissues compared with pericarcinomatous tissues; the expressions of p38(P<0.05), proliferation ability, cell migration(75±8) and S-phase fraction[(68.81±7.57)%]increased after GBC-SD cells were transfected with miR-182 mimics; proliferation ability, cell migration(23±5)and S-phase fraction [(34.49±7.05)%]decreased after the transfected GBC-SD cells were treated by SB203580. Conclusion: miR-182 is over expressed in gallbladder carcinoma, and up-regulates p38 MAPK signaling pathway to enhance the capacity of cell proliferation and migration in vitro, suggesting miR-182 may play an important role in the tumorigenesis and development of gallbladder carcinoma.

Gallbladder neoplasm/pathology MicroRNAs Cell proliferation Neoplasm metastasis

*陕西省自然科学基础研究计划项目(2015JM8389)

胆囊肿瘤/病理学 微RNAs 细胞增殖 肿瘤转移

R735.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.003

△通讯作者