优化高效液相色谱法对天然麝香的鉴别1)

赵雪飞 张晶钰 金煜

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



优化高效液相色谱法对天然麝香的鉴别1)

赵雪飞 张晶钰 金煜

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

将已有高效液相色谱(HPLC)法的样品处理过程进行优化改良；采用正交分解法设计实验的色谱条件，确定甲醇与水体积比为90∶10的比例为最优化分离方案；使用改良优化过的HPLC方法分析天然麝香和掺伪麝香的指纹图谱，然后以标准品的数据为参考确认其中是否掺有人工合成麝香酮。结果表明：使用优化后的方法可对天然麝香中是否掺有人工合成麝香酮进行鉴定，并可在一定程度上提高鉴定的准确性、速度与精度。

天然麝香；麝香酮；高效液相色谱法

天然麝香是麝科动物林麝(Moschusberezovskii)、马麝(M．sifanicus)和原麝(M．moschiferus)等成熟雄性个体香腺囊中的干燥分泌物，是重要的天然香料和中医药原料。麝香酮(3-甲基环十五烷酮)是天然麝香中最重要的药用有效成分和致香物质[1]，自1926年Ruzicka对其化学结构的研究获得突破性进展以来[2]，人工合成麝香酮的技术不断改进，合成质量也不断提高，但人工合成的麝香酮与天然麝香中存在的麝香酮是有差异的，且主要是手性上的差异。天然麝香酮为(L)型[3]，而人工合成麝香酮则多为(DL)[4]型或(R)型、(S)型和外消旋型[5](见图1)。

目前，高效液相色谱(HPLC)在中药成分分析及质量控制中的应用越来越广泛、深入[6]，张萍等曾利用HPLC法对北京联馨药业有限公司生产的10批次人工麝香进行质量检测，其中标准物质Ⅲ虽经过衍生化存在顺反异构互变，但却得到有效分离而形成两个色谱峰，证明HPLC法在手性拆分中的应用价值[7]。本文将其对样品的处理方法进行了改良优化，并将该法应用于检测天然麝香样品中是否含有人工麝香酮，以此作为天然麝香品质鉴别的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

高效液相色谱仪Waters 600E；超声波萃取仪。(L)-麝香酮(标准品Ⅰ)，大连兆羿生物酮有限公司产品，批号151013171012，纯度98.00%；(DL)-麝香酮(标准品Ⅱ)，大连兆羿生物酮有限公司产品，批号150819170818，纯度99.00%；16份天然麝香样品，采自多个药材公司；甲醇(色谱纯)，美国J.T.Baker公司产品；其余试剂为分析纯，北京化学试剂公司产品。

色谱条件：采用BOJIN系列的Launch C18H色谱柱(4.6 mm×250 mm)；以甲醇-水体积比90∶10为流动相，柱温为25 ℃，检测波长为254 nm。

1.2 溶液的制备

标准品溶液：精密称取标准品Ⅰ、标准品Ⅱ各50 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，再用针孔式微孔滤膜过滤，即配制成5 g·L-1的标准品贮备液。

供试品溶液：精密称取麝香样品0.5 g，研磨均匀置于10 mL容量瓶中，分别加入4 mL无水乙醇和1 g无水硫酸钠，室温密塞浸泡过夜。用超声波萃取仪萃取3次，每次30 min，静置至室温后取上清。SPE C18固相萃取柱用3 mL乙醇活化后加入上清萃取液，再加3 mL去离子水淋洗，然后加2 mL无水乙醇得纯化产物，再将纯化产物用针孔式微孔滤膜过滤，即得样品贮备液。

图1 麝香酮的同分异构体分子结构式

1.3 仪器方法学试验

流动相：选用体积比为95∶5、90∶10、85∶15、83∶17的甲醇-水为流动相进行实验。结果显示，当甲醇-水比例为85∶15和83∶17时，标准品Ⅱ可完全分离，但所有色谱峰完全出峰时间延长至20 min左右；当甲醇-水为95∶5时，标准品Ⅱ分离不完全；当甲醇-水为90∶10时，标准品Ⅱ的分离度较好，且运行时间最佳。因此选择流动相为90∶10的甲醇-水。

流速：选用流速0.5、1.0 mL/min进行试验。结果显示，两者均可将标准品Ⅱ完全分离，但当流速为0.5 mL/min时，出峰时间增加约1倍，因此选择流速为1.0 mL/min。

系统适用性试验：取麝香酮标准品Ⅱ贮备液，连续进样5次。结果可得(D)-麝香酮和(L)-麝香酮的分离度大于1.5，其中(D)-麝香酮峰面积占总峰面积的比例平均值为69.418%、(L)-麝香酮峰面积占总峰面积的比例平均值为30.582%，且两者峰面积比例较为稳定，系统适应性良好。

方法专属性试验：取标准品溶液、供试品溶液与空白溶液(无水乙醇和空针)分别进样，记录色谱图。结果表明，空白溶液对测定无干扰，表明该方法专属性强。

1.4 样品含量测定

精密称取麝香样品0.5 g制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。根据样品中(L)-麝香酮出峰位置和是否有(D)-麝香酮峰的存在，进行判定麝香样品中除(L)-麝香酮外，是否有人工麝香酮掺入。

2 结果与分析

2.1 标准品特征图谱

进样可知：标准品Ⅰ的(L)-型麝香酮在13 min左右有1个明显峰；标准品Ⅱ的(DL)-型麝香酮在11 min和13 min左右有2个明显峰，与标准品Ⅰ的色谱图对比可知，13 min左右峰为(L)-麝香酮，11 min左右的峰为(D)-麝香酮。

分别配制1、2、4、8倍的标准品Ⅰ、Ⅱ溶液进样，可见标准品Ⅰ在11 min左右的峰和标准品Ⅱ在11 min和13 min左右的2个峰面积，均随浓度增加而增大，峰形稳定，说明该方法可以拆分(DL)-麝香酮中的(D)-型结构、(L)-型结构。

2.2 天然麝香特征图谱

图2为天然麝香样品。由图2可见，图中11～16 min内仅在11、13 min左右有2个峰为天然麝香中成分。

图2 天然麝香样品

图3为在图2样品中人为加入1倍浓度标准品Ⅱ的麝香样品。对比可见，图3中11～16 min内明显多出2个峰。结合标准品Ⅱ(DL)-型麝香酮的色谱图中2个峰出峰时间和峰面积比，可以判断图3中12、15 min左右多出的峰，即为标准品Ⅱ中(D)-型结构、(L)-型结构的麝香酮。

图3 加入标准品Ⅱ的天然麝香样品

将图2与图3比较可见：图2在15 min左右并无明显峰，基线平稳，可以判断该麝香样品内不含有天然麝香酮，或酮含量很少已低至检测限以下。进一步比较可看出，图2在12 min左右也无明显峰，基线平稳，进而可以判断，该麝香样品中并未添加(DL)-型或(D)-型人工合成麝香酮，并可在一定程度上判断该麝香样品中所含天然麝香酮的纯度。

3 讨论

该方法在实际应用中仍存在需要继续优化之处，如，处理好的标准品和供试品溶液的保存。由于样品处理所用溶剂为乙醇，挥发性较强，因此在保存上需要特别注意，最好能做到即用即配，减少挥发损失，使得对麝香中天然麝香酮纯度的判断更加准确，进样效果更好。另外，在处理样品之前，应尽量将样品研磨均匀，防止提取时不充分，影响实验结果。麝香成分复杂，掺伪方式也经常变化，因此，在图谱中目标时间内可能出现杂峰，需谨慎辨别，不能轻易下结论。

实验证明，该方法可有效拆分(DL)-麝香酮中的(D)-型结构、(L)-型结构，并对天然麝香中是否存在外源性人工合成麝香酮作出判定，并在一定程度上判定天然麝香中所含天然麝香酮的纯度。天然麝香成分非常复杂，麝香酮含量一直是衡量其品质优劣的指标性物质，含有麝香的中成药制剂也多以测定麝香酮的含量多少控制质量[8]。麝香酮的工业化生产，不但给天然麝香的质量控制增加了难度，也为药品的安全带来了不稳定因素，所以在研究证明天然麝香酮的手性体的使用对人体无害之前，提高对天然麝香入药检测的标准是十分必要的[9]。本研究中建立的天然麝香酮的测定方法样品分离效果良好，测定时溶剂无干扰，专一性强，可作为辅助鉴定麝香品质的方法之一。

[1] 樊放.麝香鉴定之不足[J].新疆中医药，2005，23(5)：51-52.

[2] 马丽锋，陈韶蕊，申凤娟，等.麝香酮的合成进展[J].煤炭与化工，2014，37(6)：31-34，87.

[3] 郑鸿.麝香酮“手性技术”难题被破解[N].大连日报，2008-01-23(A05).

[4] 朱海军，古昆，刘志华，等.光学活性麝香酮的合成研究进展[J].云南化工，2003，30(5)：32-35.

[5] 吴恒，陈礼明，张善堂.高效液相色谱在中药研究中的应用[J].安徽医药，2009，13(8)：863-866.

[6] 林庆芳，沈霞，李晖.柱层析法分离DL-麝香酮及其同分异构体方法的研究[J].山东医药工业，2000，19(4)：14-15.

[7] 张萍，肖宣，张南平，等.人工麝香高效液相色谱特征图谱分析[J].中国医学科学院学报，2014，36(6)：587-590.

[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010．

[9] 张芳，张霞，刘春美，等.手性GC法测定麝香中麝香酮的含量[J].中国药房，2011，22(43)：4089-4091.

Optimized HPLC Method to Identify the Natural Musk//

Zhao Xuefei, Zhang Jingyu, Jin Yu
(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(6)：93-95.

Natural musk; Musk ketone; HPLC

1)国家林业局“象牙、羚羊角、麝香等库存资源动态监测”项目。

赵雪飞，女，1992年6月生，东北林业大学野生动物资源学院，硕士研究生。E-mail：1017936168@qq.com。

张晶钰，东北林业大学野生动物资源学院，工程师。E-mail：zhangjingyu@foxmail.com。金煜，东北林业大学野生动物资源学院，研究员。E-mail：947657808@qq.com。

2017年2月5日。

Q956；R284.0

The experiment was conducted to optimize the sample processing of existing HPLC method, orthogonal decomposition method was used to design chromatographic condition, to determine the optimal separation scheme of methanol/water (90∶10 in volumn). The optimized HPLC was used to identify the fingerprints of natural musk and adulteration musk, with standard data as reference to confirm whether laced with synthetic musk ketone. The optimized method can identify natural musk laced with synthetic musk ketone with good performance in identification accuracy, speed and precision.