氯霉素ELISA可视化微阵列芯片检测试剂盒评价研究

2017-06-28杜兵耀文芳臧长江邵伟李昊张养东杨开伦余雄姜金斗巩军

中国乳品工业 2017年5期

杜兵耀，文芳，臧长江，邵伟，李昊，张养东，杨开伦，余雄，姜金斗，巩军

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐830052；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；3.农业部乳品质量监督检验测试中心（哈尔滨），哈尔滨150090)

杜兵耀1,2，文芳2，臧长江1，邵伟1，李昊1，张养东2，杨开伦1，余雄1，姜金斗3，巩军3

为了了解氯霉素ELISA可视化微阵列芯片检测试剂盒的有效性和可靠性，从灵敏度、特异性、准确度、可重复性、检出限、耐变性、批间变异等方面进行了评价，结果表明该试剂盒在测试范围内线性回归良好，相关系数R2可达0.9943，与结构相似的甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反应率均小于1%，批间变异系数小于20%，牛奶中的平均回收率为108.5%，检出限为0.067 μg/L，该试剂盒有较好的准确性、特异性与重复性，耐变性与批间变异均在可接受范围内，可用于牛奶样品中氯霉素的残留检测。

氯霉素；ELISA；试剂盒；评价

0 引言

氯霉素(Chloramphenicol,CAP)是广泛应用的广谱抗菌剂，具有良好的药物代谢动力学性能，且价格低廉，常用于治疗传染性动物疾病。但由于氯霉素存在严重的副作用，能导致严重的慢性毒性反应、骨髓抑制、再生障碍性贫血等疾病，得到广泛的关注，世界各国已明令禁止使用[1-5]。因此，快速、灵敏的方法用以检测牛奶中的氯霉素残留是极其重要的。传统的仪器分析方法费用昂贵、操作复杂、前处理过程繁琐[6]。相反，ELISA检测方法由于操作简单、快速、便携、成本低而得到广泛的应用。因此氯霉素的ELISA试剂盒的质量保障显得尤其重要。鉴于国家试剂盒的生产者、使用者、监管者对试剂盒评价的迫切需要，选择了与食品质量安全息息相关的试剂盒进行检测指标的评价研究，依托商品化食品检测试剂盒评价方法验证指南[7]，并参照农业部关于加强兽药残留检测试剂（盒）管理的通知等[8-9]，从检出限、选择性、回收率与准确度、耐变性、批间差异与稳定性等方面进行评价。

1 实验

1.1 材料与仪器

天平（XS205，AL204），芯片扫描仪（MRS-4800QA），涡旋振荡器（Vortex-Genie2），恒温震荡孵育器（MTS-2）,超低温冰箱（BCD-649WADV）,ELISA可视化微阵列芯片检测试剂盒。

氯霉素，甲砜霉素，氟甲砜霉素，恩诺沙星，四环素，链霉素，林可霉素，头孢氨苄，红霉素标准品。乙酸乙酯、正己烷（均为分析纯），氯霉素标准溶液，终止液，复溶工作液，洗涤工作液。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

称取1.00 g±0.05 g均质样品至15 mL聚苯乙烯离心管中，加入6 mL乙酸乙酯，涡旋振荡混匀，在10 000 r/min转速下离心5 min。移取3 mL上层的乙酸乙酯至10 mL干净干燥的玻璃试管中，于50℃条件下氮气吹干。然后加入1 mL正己烷，涡旋震荡1 min，再加入0.5 mL复溶工作液，涡旋震荡3 min后，在10 000 r/min条件下离心5 min，除去上层有机相，取下层水相25 μL，待检。

1.2.2 检测步骤

依次加入25 μL样品或标准品和25 μL抗体工作液到各自的微孔中，轻轻混匀，25℃（600 r/min）条件下反应45 min。将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μL/孔，充分洗涤3次，每次间隔10 s。加入二抗工作液50 μL/孔，轻轻混匀，37℃(600 r/min）条件下反应30 min。显色液A和B按照1∶1的比例混匀，每孔加入混合的显色液50 μL，37℃（600 r/min）避光的条件下反应12 min。将显色后的芯片放入芯片分析仪中获取图像，用芯片专用软件进行自动化分析，自动生成结果报告。

1.2.3 标准曲线的测定

精密称取氯霉素标准品适量，用甲醇将其溶解得1 g/L的标准储备液，4℃保存，用缓冲液将氯霉素标准储备液进行稀释，配制标准溶液，使氯霉素的质量浓度为0，0.03，0.10，0.30，0.90，2.70 μg/L；按步骤1.2.2进行检测。每种质量浓度做2个平行，6个平行分3 d进行，对照组为不加任何药物的样品稀释液。

1.2.4 选择性的测定

用不含氯霉素的牛奶按1.2.1步骤进行样品前处理，所得溶液分别用以配制氯霉素的标准溶液，对照组为不加任何药物的空白溶液分别配制的氯霉素标准溶液，氯霉素的质量浓度水平分别为0.03，0.1，0.3，0.9，2.7 μg/L；并按1.2.2步骤测定其标准曲线和IC50值。分别配制氯霉素的标准溶液，质量浓度水平分别为0.03，0.1，0.3，0.9，2.7 μg/L；甲砜霉素、氟甲砜霉素的标准溶液，质量浓度水平为0，1，3，9，27，81 μg/L；质量浓度水平分别为0，1.5，5，15，45，120 μg/L；并按1.2.2步骤测定其标准曲线和IC50值。

1.2.4.1 基质的选择性

配制氯霉素标准溶液，使氯霉素的质量浓度为0，0.03，0.10，0.30，0.90，2.70 μg/L；分别用10种不同的基质配制加标的样品，添加质量浓度为0.5 μg/L)，每种基质3个平行，对照组为不加任何药物的样品稀释液。按步骤1.2.2进行检测。

1.2.4.2 药物的选择性

配制氯霉素标准溶液，使氯霉素的质量浓度为0，0.03，0.10，0.30，0.90，2.70 μg/L；分别配制恩诺沙星：100 μg/L，四环素100 μg/L，链霉素200 μg/L，林可霉素150 μg/L，头孢氨苄100 μg/L，红霉素40 μg/L的加标样品，每种药物3个平行，对照组为不加任何药物的样品稀释液。按步骤1.2.2进行检测。

1.2.5 准确度与重复性的测定

采用样品加标进行回收率实验，样品按照1.2.1步骤进行处理，对6个质量浓度水平进行实验，氯霉素的质量浓度水平分别为0，0.1，0.3，0.5，1；每个水平8个平行，按1.2.2步骤检测。

1.2.6 耐变性的测定

氯霉素添加质量浓度为0.5 μg/L，每种测试条件8平行。进行4因素2水平的正交检测。A：7 mL乙酸乙酯；a：5 mL乙酸乙酯；B：20℃；b：30℃；C：40 min；c：50 min；D：4次；d：2次。按1.2.1和1.2.2步骤进行前处理和检测。

1.2.7 稳定性的测定

分别取3个不同批次的试剂盒对样品进行检测，样品按照1.2.1步骤进行处理，氯霉素添加质量浓度为0.5 μg/L，每批试剂盒8平行，按1.2.2步骤检测。

2 结果

2.1 标准曲线的测定

对3 d的重复结果进行回归分析，标准曲线如图1所示，其拟合方程为

式中：x为质量浓度值；y为对应信号值。氯霉素半抑制质量浓度(IC50值)为0.206 μg/L，用来衡量抗体灵敏度的半抑制率越低，说明抗体灵敏度越高。

图1 氯霉素的标准曲线

2.2 选择性验证

2.2.1 同类药物的选择性验证

根据检测结果绘制氯霉素的标准曲线，以及甲砜霉素、氟甲砜霉素的工作曲线，并计算半抑制率IC50值，根据各药物的IC50值计算交叉反应率，计算公式为：氯霉素的交叉反应率=IC50值(氯霉素)/IC50值(各药物)×100%，结果如表1所示。由表1可以看出，氯霉素与甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反应率均低于1%，这说明该试剂盒对氯霉素有很强的特异性，其他药物对试验的干扰也很小。

表1 几种结构类似物对氯霉素的交叉反应率

2.2.2 不同基质的选择性

检测结果如图2所示。由图2可以看出，检测值在0.28～0.87 μg/L之间，平均值为0.614，计算出变异系数为10%。说明不同的基质对检测结果影响不大。

图2 不同基质的选择性

2.2.3 不同药物的选择性

测定结果如表2所示。由表2可以看出，测定结果在0.03～0.06 μg/L之间，均为小于0.1，说明其他药物对检测结果影响不大，不宜作为可显著影响检测结果的因素。

表2 不同药物的选择性μg/L

2.3 回收率的验证

根据检测结果分别绘制氯霉素的标准曲线，计算回收率，回收率的计算公式如下：回收率=(加标样品测定值-空白样品测定值)/加标值，结果如表3所示。

表3 加标回收率

由表3可以看出，氯霉素的回收率在90%～126%，平均回收率为108.5%，变异系数在7%～26%，平均变异系数为15%，在样品的氯霉素加标回收率的试验中，变异系数均在可允许的范围内波动，说明该检测试剂盒有较好的准确性与重复性，可以用于牛奶的检测。

2.3.2 检测限LOD

以20份空白样品测定的值的平均值加上3倍的标准偏差计算出检测限。经计算得，牛奶样品的检测限是0.067 μg/L

2.4 耐变性

测定结果如表4所示。由表4可以看出，测定结果在0.42～0.58 μg/L之间，平均值为0.52 μg/L，计算其变异系数10.83%，说明各因素对计算结果影响不大，不宜作为可显著影响检测结果的因素。

表4 耐变性的测定结果

2.5 批间差异与稳定性

计算不同时间的每批次产品的测定平均值和相对标准偏差，结果如表5所示，3个批次中，牛奶的批间变异系数分别为4.9%，14.5%，16.6%；均小于20%，稳定性良好。

表5 批间差异的测试结果

3 结论

随着科学技术的突飞猛进和人们生活水平的日益提高，人们的食品安全意识也越来越高，对牛奶的质量安全也逐渐重视起来。因此需要不断的完善各种检测技术，来保证牛奶质量的安全。试剂盒由于检测成本低、操作简单、耗时短而得到广泛的应用，逐步成为基层单位和偏远地区快速检测的主要手段，但是，试剂盒的稳定性、灵敏度、假阳性、假阴性等方面也存在一下问题，因此，建立试剂盒评价方法是必要的。实验结果表明该试剂盒在测试范围内线性回归良好，相关系数R2可达0.9943，与结构相似的甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反应率均小于1%，批间变异系数小于20%，牛奶中的平均回收率为108.5%，检出限为0.067 μg/L，该试剂盒有较好的准确性、特异性与重复性，耐变性与批间变异均在可接受范围内，可用于牛奶样品中氯霉素的残留检测。

[1]KARTHIK R,GOVINDASAMY M,CHEN S M,et al.Green syn⁃thesized gold nanoparticles decorated graphene oxide for sensitive de⁃termination of chloramphenicol in milk,powdered milk,honey and eye drops[J].Journal of Colloid and Interface Science,2016,475:46–56.

[2]WANG TT，ZHANG D，ZHANG Z L，et al.Synchronized separa⁃tion,concentration and determination of trace chloramphenicol,thi⁃amphenicol and florfenicol in food by using polyoxyethylenecetyl ether-salt aqueous two-phase system coupled with high-performance liquid chromatography[J].Journal of the Iranian Chemical Society, 2016,13(10)：1759–1765.

[3]MIAO Y B,REN H X,GANA N,et al.A homogeneous and“off–on”fluorescence aptamer-based assay for chloramphenicol using vesi⁃cle quantum dot-gold colloid composite probes[J].AnalyticaChimi⁃caActa,2016,929:49-55.

[4]徐修远,滑静,胡建民,等.氯霉素在动物体内残留问题的研究进展[J].中国畜牧兽医,2004，31(10):20-21.

[5]巩军,褚中秋,姜金斗,等.超高效液相色谱—三重四级杆质谱测定乳与乳制品中氯霉素的残留[J].中国乳品工业,2012,40(7):50-52.

[6]ZHANG Z W,WUY P,LI X W,et al.Multi-class method for the determination of nitroimidazoles,nitrofurans,and chloramphenicol in chicken muscle and egg by dispersive-solid phase extraction and ul⁃tra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrome⁃try[J].Food Chemistry,2017,217:182–190.

[7]SN/T 2775—2011,商品化食品检测试剂盒评价方法[S].北京:中国标准出版社,2011：1-10.

[8]何田田,薛强,段潜,等.氯霉素ELISA检测试剂盒评价技术[J].食品科技,2013,38(2):311-314.

[9]刘智宏,叶妮,郭文林,等.四环素类药物多残留酶联免疫检测方法[J].中国农业科学,2009,42(1):318-323.

Evaluation techniques of detecting chloramphenicol by ELISA-Based visualiza⁃tion microarray chip

DU Bingyao1,2,WEN Fang2,ZANG Changjiang1,SHAO Wei1,LI Hao1,ZHANG Yangdong2,YANG Kai⁃lun1,YU Xiong1,JIANG Jindou3,GONG Jun3
(1.College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 8300523，China；2.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；3.Ministry of agriculture dairy quality supervision and testing center(harbin),harbin 150090，China)

In order to understand the effectiveness and reliability of domestic Chloramphenicol ELISA-based visualization microarray chip kit,evaluated in terms of sensitivity,specificity,accuracy,reproducibility,the detection limit,stability and inter-assay coefficients of variation. The results showed that the kit had a regression line of and correlation coefficient 0.9943.It showed less than 1%cross-reactivity with thiam⁃phenicol and florfenicol,which was similar to chloramphenicol in structure.The inter-assay coefficients of variation is less than 20%,and the rate of recovery for chloramphenicol from milk was 108.5%,the corresponding the detection limit was 0.067 μg/L,This kit had a good accu⁃racy,speci city and reproducibility,its stability and inter-assay were both in the acceptable range.This kit can be used in melamine detection from milk and milk powder.

chloramphenicol;ELISA;kit;evaluation

TS252.7

1001-2230（2017）05-0047-04

2016-12-20

国家现代农业产业技术体系建设专项（nycytx-04-01）。

杜兵耀(1990-)，男，硕士，从事动物营养与牛奶质量安全的研究。

文芳