0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯对4种藻类生长的影响

景江，夏林军，吴菊珍,孙磊

1. 成都工业学院，成都 6117302. 泛华建设集团有限公司成都市政规划设计院，成都 610000

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯对4种藻类生长的影响

景江1,*，夏林军2，吴菊珍1,孙磊1

1. 成都工业学院，成都 6117302. 泛华建设集团有限公司成都市政规划设计院，成都 610000

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯(敌百虫)为广谱杀虫剂，用途广泛，但对藻类的毒理学效应研究还有待完善。采用4种受试藻样，设置5个敌百虫浓度组(1、5、10、50和100 mg·L-1)和对照组，实验周期40 d，藻细胞的初始接种密度106cells·mL-1，光暗比12 h/12 h，24 h曝气，24 h磁力搅拌，实验温度25 ℃，pH 6.8，每隔24 h取样。结果表明：5 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1浓度的敌百虫对铜绿微囊藻和小球藻的生长有促进作用，其中以50 mg·L-1浓度组的促进作用最为显著，促进作用主要表现在生长峰值的延后以及生长对数期的延长，而高剂量(100 mg·L-1)的敌百虫则有抑制藻生长的作用。取50 mg·L-1敌百虫浓度组以及铜绿微囊藻和小球藻作进一步深入研究，结果表明：50 mg·L-1敌百虫浓度组的叶绿素a含量峰值比对照组高30%，细胞体内的SOD、ATP含量都高于对照组。敌百虫的使用浓度通常在0.1～1.0 mg·L-1，低于本实验最佳浓度。本实验中1 mg·L-1敌百虫对藻生长影响效果不明显。

敌百虫；铜绿微囊藻；小球藻；细胞密度；叶绿素a；SOD；ATP

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯，商品名为敌百虫，主要成分为90%敌百虫原粉，80%可溶性粉剂，属低毒、广谱杀虫剂[1]。通过抑制机体乙酰胆碱酯酶使乙酰胆碱在突触处积累，从而抑制神经传导，引起生物功能紊乱，导致死亡[2]。不但可以在水稻、棉花等大田作物上防治多种害虫，也可用于治疗鱼类的细菌性疾病，防治体外寄生虫，杀灭寄生在鱼体肠道内的寄生虫及浮游动物[3]，在水产养殖中，0.1～1.0 mg·L-1敌百虫通常用于防治水生昆虫对养殖对象的疾病感染和蠕虫的体外寄生，同时也可用于控制水体中的浮游生物。但长期反复使用敌百虫，将导致杀虫剂残留在水体及淤泥中富集，造成水域化学污染，对鱼、蟹、虾类等非靶标生物中的有益生物产生直接毒性[4]。目前有关敌百虫的水生态毒理学研究多以水生甲壳类、鱼类以及养殖生物为主，藻类毒理学方面则以淡水藻类为研究重点[5-6]，而有关海洋微藻研究较少。敌百虫对鱼类和水生动物的毒性很高，半数致死浓度(LC50)一般为0.05～1 mg·L-1。相对于鱼类及水生甲壳类动物，敌百虫对藻类的毒性较低，72 h或96 h的半效应浓度(EC50)一般大于1 mg·L-1[7]；并且环境中低浓度的敌百虫等有机磷农药可作为营养源，促进藻类生长[8]。

蓝藻是水生生态系统中的重要组成部分，平衡稳定着整个水生态系统的。而蓝藻的大量生长可以恶化水体的通风及光照条件，抑制水体中浮游生物有益种类的生长繁殖，阻碍水中植物的光合作用，挤占其他水生生物的生存空间[9]。蓝藻生命力强，越冬期生活在湖泊的底泥中，遇到适合其生长的外部环境条件时，再次复苏[10]。

本文选用4种藻类作为受试对象，分别为铜绿微囊藻、鱼腥藻、普通小球藻、念珠藻，其中小球藻属于绿藻，是养殖水体中常见的主要藻类之一，且与一些蓝藻形成一定的竞争效应[11-12]。如表1所示，所选藻类都属于常见藻，但特征、习性、分布都具有一定的差异性[13-17]。本文通过实验，研究不同浓度的敌百虫对4种藻类是否有影响，是否能够促进或者抑制藻类的生长，以及在藻类的对数期、稳定期和衰亡期等生命周期中有何影响。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

藻种：鱼腥藻PCC 7120(Anabaena sp. PCC 7120)，Allen’s培养基；普通小球藻CHX-1(Chlorella sp. CHX-1)、念珠藻106(Nostoc sp.106)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)，BG11培养基；藻种由中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)提供，培养温度为25 ℃，可见光照强度2 000 Lux，pH 6.8，实验前，在对数生长期接种2～3次，使藻种保持良好的活性，并达到同步生长。

表1 实验藻种Table 1 Experimental algae

Allen’s培养基：1.50 g·L-1NaNO3，0.038 g·L-1MgSO4·7H2O，0.013 g·L-1CaCl2·2H2O，0.03 g·L-1柠檬酸，0.04 g·L-1K2HPO4，0.02 g·L-1Na2CO3，0.029 g·L-1Na2SiO3·9H2O，1 mL·L-1金属元素溶液PIV。

BG11培养基：1.50 g·L-1NaNO3，0.04 g·L-1K2HPO4·3H2O，0.075 g·L-1MgSO4·7H2O，0.036 g·L-1CaCl2·7H2O，0.001 g·L-1Na2EDTA，0.02 g·L-1Na2CO3，0.006 g·L-1柠檬酸，0.006 g·L-1柠檬酸铁铵，1 mL·L-1微量元素A5溶液。

0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯(敌百虫)，由成都科龙化工试剂公司提供，分析纯(AR)；其余所用试剂均为分析纯(AR)，由成都科龙化工试剂公司提供。

实验仪器包括：高速台式离心机H3—18KR(重庆松朗仪器有限公司)，超声波细胞粉碎机JY92—Ⅱ(宁波新芝生物科技有限公司)，可见分光光度计721G(上海精密科学仪器有限公司)，生化培养箱LRH—250 (上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 敌百虫对藻生长影响实验

将生长至对数期的铜绿微囊藻接种于6个1 000 mL锥形瓶中，藻液接满1 000 mL。设置5个敌百虫浓度组(1、5、10、50和100 mg·L-1)和1个对照组，实验周期40 d。藻细胞的初始接种密度106cells·mL-1。光暗比12 h/12 h、24 h曝气、24 h磁力搅拌，实验温度25 ℃，pH 6.8，每隔24 h取样分析。其他3种藻样的实验方法、条件相同。

实验采用2种培养基，其中营养盐总氮(TN)、总磷(TP)起始浓度相同，均为245 mg·L-1与7.2 mg·L-1。实验周期中保证TP、TN浓度始终维持在超富营养状态。总氮和总磷的测定分别采用硫酸肼还原法和钼蓝法(国家海洋局，2007)[18]。

1.3 藻密度的吸光度值测定

参照刘加慧等[19]和郝聚敏等[20]的方法，取对数生长期藻细胞培养液，稀释成不同藻细胞数量，用分光光度计测680 nm下的光密度值(OD680)，每天定时取样测定，每组设3个平行样。得到680 nm的光密度值与藻细胞数量的相关关系，相应的回归方程为：小球藻细胞浓度(万个·mL-1)=1557OD680-34.716，以光密度值代表小球藻的生长情况。

4种藻类的相关关系有差异性，其他3种藻类也通过此实验方法得到680 nm与藻细胞数量的关系。

1.4 叶绿素a(Chl a)测定实验

采用分光光度法，根据Hall和Rao[21]的方法略做改进。每隔24小时取5 mL(定为V1)藻液于10 mL离心管中，超声破碎30 s(工作时间1 s，间隔2 s)，在样品中加入20 μL 1%(质量分数)的MgCO3溶液，8 000 r·min-1下离心15 min，弃去上清液。在沉淀中加入3 mL丙酮溶液，于4 ℃冰箱中过夜萃取18～24 h，于7 000 r·min-1下离心10 min，取上清液，分别测定750、663、645和630 nm的OD值，取上清液的体积为V2，利用下式计算Chl a(mg·mL-1)：

Chla=[11.64×(OD663nm-OD750nm)-2.16

×(OD645nm-OD750nm)+0.1(OD630nm-OD750nm)]

V2(mL)/V1(mL)

1.5C-PC藻蓝蛋白含量的测定

参照Padgett和Krogmann[22]的方法，在分光光度计下测量藻蓝蛋白在620nm和650nm的OD值，用以下公式计算：

C-PC(mg·mL-1)=(166×OD620nm)-(108×OD650nm)

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)的测定

SOD的测定根据Stewert(1980)的方法[23]，在25 ℃，在4.5mL的50mmol·L-1K2HPO4-KH2PO4缓冲液中加入待测样品的SOD粗酶液，再加入10μL50mmol·L-1连苯三酚，迅速摇匀，将摇匀的反应液立即倒入光径为1cm的比色杯内，分光光度计325nm波长下每隔30s测OD值(A)一次，要求连苯三酚的自氧化速率控制在0.07A·min-1左右，对照管取10mmol·L-1HCl代替。测得数据按下式计算：

酶活性(U·mL-1)=[0.07-OD325nm/时间(min)]/0.07×100%/50%×反应液总体积(mL)×样液稀释倍数/样液体积(mL)

1.7ATP含量的间接测定法

ATP含量的测定采用《环境工程微生物检验手册》[24]中的方法，取1cm2的藻样，将其加入装有1mL蒸馏水的比色管中，完全混合，加入2.5mL质量分数为95%的硫酸，然后用纱布盖上用绳扎紧，置高压锅加压，128 ℃，15min后取出。室温下冷却后，加1～2滴过氧化氢液，摇匀，用去离子水稀释，此为消化液。取2支试管，其中1支加入消化液3mL，摇匀，另1支加蒸馏水3mL，各管加定磷试剂3mL后，同置45 ℃水浴25min，取出冷却至室温，在721G分光光度计上660nm处比色测定。

2 结果(Results)

2.1 敌百虫对4种受试藻生长速度的影响

由图1所示，敌百虫加入后，4种藻样的生长均受到了不同程度的影响，其中以铜绿微囊藻和小球藻最为明显。在铜绿微囊藻的实验中，敌百虫浓度为50mg·L-1时，藻受到的影响最大，对数生长期持续时间比对照样品长，50mg·L-1浓度组的藻在25d后进入生长稳定期，并且一直保持着高活性，对照组第40天已经进入衰亡期，细胞密度持续减少，而50mg·L-1浓度组细胞密度达到32×106cells·mL-1，比对照组高出80%，生长稳定，没有进入衰亡期。在小球藻的实验中，不同浓度组的敌百虫均对小球藻的生长产生了影响，其中50mg·L-1浓度组对小球藻生长有较明显的促进作用，而高浓度组100mg·L-1对小球藻的生长有抑制作用，在40d的实验周期中，最高细胞密度达到15×106cells·mL-1，仅为对照组的75%，说明高浓度的敌百虫对小球藻有毒害作用，抑制了藻的生长；但进入衰亡期后，细胞衰减速度较缓慢，第40天时，细胞密度为对照组的85%，相对而言有所上升，说明随着实验时间的延长，敌百虫产生生物降解或者水解，小球藻发生补偿生长，而同样的情况也出现在鱼腥藻和念珠藻的实验中。王秀红等[25]发现丁草胺浓度在4～20mg·L-1范围内可促进3种鱼腥藻生长，大于20mg·L-1时抑制生长。此结果与本文实验现象有一定的相似性，说明一定浓度的有敌百虫对藻的生长有促进作用，而浓度高于临界点后就会出现抑制作用，本文结果显示，100mg·L-1敌百虫超出了临界浓度，对藻前期生长抑制力度很强，对藻有明显的致害作用，生命周期内的藻活性较低，与其他浓度组差异性较大。

蓝藻的生命周期一般为30d，而由于有机磷农药敌百虫的加入，影响了蓝藻的生命周期，由传统的适应期、对数期、稳定期、衰亡期的规律性生命周期变得不规律，整个生命周期有所延长是实验中较明显的特征。因此，选择铜绿微囊藻和小球藻以及敌百虫50mg·L-1浓度组，做进一步研究实验。

图1 敌百虫对藻生长的影响注：a-铜绿微囊藻；b-鱼腥藻；c-小球藻；d-念珠藻。Fig. 1 Effect of trichlorfon on the growth of algaeNote: a-Microcystis aeruginosa; b-Anabaena sp. PCC 7120; c-Chlorella sp. CHX-1; d-Nostoc sp.106.

2.2 叶绿素a含量影响

在藻的光合作用中叶绿素a是不可缺少的催化剂，绿素a的含量直接反应了藻生长代谢的活性[26]。由图2所示，在铜绿微囊藻的实验中，敌百虫50 mg·L-1浓度组在进入生长稳定期后绿素a含量在25 d时达到峰值，同期比对照组高出30%，在衰亡期时，敌百虫50 mg·L-1浓度组叶绿素a含量呈现缓慢的下降趋势，但仍然保持着一定的活性。相似的情况也出现在小球藻的实验中，由此可见，50 mg·L-1敌百虫浓度组对藻的生长有正面刺激作用，细胞生长代谢活性较高，峰值延后说明延长了藻的生长对数期时间。

图2 敌百虫对藻叶绿素a的影响注：a-铜绿微囊藻；b-小球藻。Fig. 2 Effect of trichlorfon on the algal Chl a Note: a-Microcystis aeruginosa; b-Chlorella sp. CHX-1.

2.3 藻蓝蛋白(C-PC)含量的影响

藻蓝蛋白与叶绿素a在藻的光合作用中起着同等重要的作用，在藻类细胞中光合作用的一部分，将捕获的光能传递给叶绿素a[27]。

由图3所示，铜绿微囊藻对照组C-PC含量在20 d达到峰值，而敌百虫50 mg·L-1浓度组延迟到第25天达到峰值，且高出对照组30%，其生长对数期持续时间更长。在小球藻的实验中，生命周期延长的现象明显，峰值延迟。40 d时，敌百虫50 mg·L-1浓度组藻细胞内C-PC含量仍较高，说明其体内活性蛋白较多，补光系统、光合作用系统完整。

图3 敌百虫对藻蓝蛋白(C-PC)含量的影响注：a-铜绿微囊藻；b-小球藻。Fig. 3 Effect of trichlorfon on the phycocyanin (C-PC) Note: a-Microcystis aeruginosa; b-Chlorella sp. CHX-1.

2.4 ATP含量的影响

微生物体内ATP可以指示其生物活性[28]。线粒体产生ATP为细胞内进行的大多数生命过程提供了能量，ATP合成复杂，主要是由包埋在线粒体内膜中的一系列的分子复合物，借助O2从营养物获取能量制造ATP，不幸的是线粒体从营养物中获得能量的同时作为副产物产生了自由基(如O2·-，H2O2，·OH)。为了清除这些游离的自由基，以防止细胞发生脂质过氧化反应，由SOD作出的抗氧化动态平衡使细胞得到了保护，但周期末期正常藻细胞发生衰亡，导致上述的动态平衡失衡，膜脂质过氧化，从而破坏叶绿体结构，致使叶绿素含量下降，细胞生长受阻[29]。图4所示，铜绿微囊藻在进入生长稳定期后，敌百虫50 mg·L-1浓度组生长活性一直高于对照组，且下降趋势较对照组缓慢。小球藻在对数生长期ATP含量，敌百虫50 mg·L-1浓度组低于对照组，但是对数期延续时间长，且峰值含量高于对照组，说明小球藻在初期可能受到敌百虫的致害影响，而后期敌百虫含量降低后，出现了超补偿生长。

图4 敌百虫对藻ATP含量的影响注：a-铜绿微囊藻；b-小球藻。Fig. 4 Effect of trichlorfon on the algal ATP Note: a-Microcystis aeruginosa; b- Chlorella sp. CHX-1.

2.5 SOD含量的影响

在叶绿体中，O2·-活性氧的清除是通过SOD酶来催化完成的，当这种清除体系遭到破坏时，导致O2·-积累，进而引起H2O2积累，就会导致膜脂质过氧化，从而破坏叶绿体结构，致使叶绿素含量下降，细胞生长受阻[30]，因此SOD含量的高低代表了藻细胞抗氧化功能的强弱，也反应了藻细胞的抵抗能力，图5可见，铜绿位囊藻与小球藻在生长末期细胞体内的SOD含量，敌百虫50 mg·L-1浓度组均高于对照组，同比其生长对数期分别降低了14%和10%，对照组SOD含量正常下降约60%，说明藻细胞内抗氧化系统不能保持平衡，藻细胞的抵抗力较差，死亡率大于生长率。Wu等[31]研究表明，蓝藻在铜的作用下，SOD和过氧化氢酶活性均比空白显著增加，其增加的SOD活力用于对抗增加的氧化压力。与本实验结果有很大的相似性，说明敌百虫浓度组细胞体内基本能够维持抗氧化功能，抗氧化压力明显高于对照组，在生长末期的抗逆能力显著增加。

图5 敌百虫对藻SOD含量的影响注：a-铜绿微囊藻；b-小球藻。Fig. 5 Effect of trichlorfon on the algal SOD activity Note: a-Microcystis aeruginosa; b-Chlorella sp. CHX-1.

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Toxic Effects of 0,0-Two-(2,2,2-Three Chloro-1-Hydroxy Ethyl) Phosphate on Four Kinds of Algae Growth

Jing Jiang1,*, Xia Linjun2, Wu Junzhen1, Sun Lei1

1. Chengdu Technological University, Chengdu 611730, China2. Chengdu Municipal Planning and Design Institute, FanHua Construction Group Limited Company, Chengdu 610000, China

12 Semptember 2016 accepted 4 January 2017

0,0-two-(2,2,2-three chloro-1-hydroxy ethyl) phosphate (trichlorfon) is widely used as pesticides, while its toxic effect on algae is still not well understood. The experiment adopts four algal species to be exposed to 5 different trichlorfon concentration groups (1, 5, 10, 50, 100 mg·L-1) and 0 mg·L-1as control group. The experimental period is 40 days, and the initial inoculation density of algal cells is 106cells·mL-1with the light dark ratio 12 h/12 h, 24 h aeration, 24 h magnetic stirring, the experimental temperature 25℃, pH 6.8. Samples are taken in every 24 h. Results show that 5 mg·L-1, 10 mg·L-1and 50 mg·L-1of trichlorfon has a promoting effect on the growth of Microcystis aeruginosa and Chlorella sp. CHX-1, and thereinto 50 mg·L-1group has the most significant effect. The promoting effect is mainly manifested in the delay of the growth peak and the extension of the exponential phase, and high doses of trichlorfon (100 mg·L-1) inhibit the growth of algae. The further study shows that the peak of algal Chl a in 50 mg·L-1trichlorfon group is 30% higher than the control group, and the SOD content and ATP content in the cells are higher than control group. Working concentration of trichlorfon is 0.1-1.0 mg·L-1, which is lower than the concentration of this study. The 1 mg·L-1trichlorfon group has no obvious effect on the growth of algae.

trichlorfon; Microcystis aeruginosa; Chlorella sp; cell density; Chl a; SOD; ATP

四川省科技厅重点项目(2011ZR0139)；四川省教育厅项目(15ZB0309)

景江(1982-)，男，讲师，硕士，研究方向为地表水环境、蓝藻水华治理，E-mail: 25859260@qq.com；

10.7524/AJE.1673-5897.20160912004

2016-09-12 录用日期：2017-01-04

1673-5897(2017)2-094-08

X171.5

A

景江, 夏林军, 吴菊珍, 等. 0,0-二甲基-(2,2,2-三氯-1-羟基乙基)磷酸酯对4种藻类生长的影响[J]. 生态毒理学报，2017, 12(2): 94-101

Jing J, Xia L J, Wu J Z, et al. Toxic effects of 0,0-two-(2,2,2-three chloro-1-hydroxy ethyl) phosphate on four kinds of algae growth [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 94-101 (in Chinese)