不同白毛夏枯草提取物抗肝癌机制分析

吴 航，令小峰

1.青海省中医院(西宁810000)，2. 西宁市食品药品监督管理局(西宁810008)

·实验研究·

不同白毛夏枯草提取物抗肝癌机制分析

吴 航1，令小峰2

1.青海省中医院(西宁810000)，2. 西宁市食品药品监督管理局(西宁810008)

目的：以白毛夏枯草水提取物、乙酸乙酯提取物为例探究不同提取物的抗肝癌机制。方法：将白毛夏枯草的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)分别作用于肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721。运用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的STW、ZTW对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721增生的抑制作用，通过流式细胞仪检测不同浓度的STW、ZTW诱导肝癌HepG2和SMMC-7721细胞凋亡的凋亡率，运用一步法荧光RT-PCR(Real-time PCR)技术检测经不同浓度的STW、ZTW处理后HepG2和SMMC-7721细胞中Bax mRNA的表达情况。结果:STW、ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞均有显著的抑制增生和诱导其凋亡的作用，同时能够抑制肝癌血管增殖。STW、ZTW的抑制机制呈一定的浓度依赖性，其中以乙酸乙酯提取物ZTW抑制性最强。结论:白毛夏枯草水提取物、乙酸乙酯提取物均通过抑制肝癌细胞增生，诱导细胞凋亡，抑制肝癌血管增殖，加速肝癌细胞分化等机制来抗肝癌。

白毛夏枯草最早载于《本草纲目拾遗》，为双子叶唇形科草属植物，有性味苦寒、归肺肝经，专清肝火之效[1]。目前白毛夏枯草及其提取物被广泛运用于现代药理学和临床研究中，近年来国内外相关专家又提出白毛夏枯草在抗肝癌方面有着显著地效果[2-3]。本研究旨在探究不同白毛夏枯草提取物对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721增殖的抑制作用，推测其抗肝癌机制，现报告如下。

材料与方法

1 材 料 白毛夏枯草水提取物和乙酸乙酯提取物、肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721、小牛血清、MTT粉剂、5-FU、青霉素、链霉素、PCR试剂盒(以上实验材料均由本院实验室采购)。

2 方 法

2.1 实验准备:将白毛夏枯草在完全干燥状态下用水和乙酸乙酯萃取，将萃取出的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)分别置于4℃恒温箱保存备用；将肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721置于含10 %小牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素的培养基中培养，取对数生长期的HepG2和SMMC-7721细胞备用；根据萃取试剂的不同将提取物分为STW组和ZTW组，并设置空白组作为对照，STW组和ZTW组均设置4 mg/ml、1 mg/ml、0.25 mg/ml三种浓度。

2.2 用MTT法检测STW、ZTW对肝癌细胞抑制效果:将肝癌HepG2和SMMC-7721细胞植入培养板，培养完毕后加入不同浓度的STW、ZTW，随后加入10 μl规格为5 g/L的MTT继续培养。4 h后，加入DMSO溶解，震荡10 min后用酶联免疫仪490 nm波长测定OD值，并计算抑制率。

2.3 运用流式细胞仪检测STW、ZTW对肝癌细胞凋亡率的影响:将浓度为300 μg/ml的STW和ZTW给予对数生长期的HepG2和SMMC-7721细胞中，空白组加入培养液进行培养，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4 运用荧光RT-PCR(Real-time PCR)技术检测经STW、ZTW处理后HepG2和SMMC-7721细胞中Bax mRNA的表达情况。将两种肝癌细胞接种于细胞培养皿中培养1d，加入浓度为4 mg/ml的STW、ZTW，直至孔中终浓度为2(μg·ml)。停留适当时间(0.5、1、3、6、12 h)后，用PCR试剂盒提取总RNA，并通过合成、扩增得到所需的mRNA。

结 果

1 不同浓度STW对HepG2和SMMC-7721细胞增生的抑制作用 STW能显著抑制肝癌细胞的增生，并有一定的浓度依赖性。与空白组相比，组间差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度 STW对HepG2和SMMC-7721细胞的抑制作用((mg/ml))

2 不同浓度ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞增生的抑制作用 ZTW同样能有效抑制肝癌细胞的增生，呈一定的浓度依赖性。与空白组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度 ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞的抑制作用(mg/ml)

3 流式细胞仪对肝癌细胞凋亡率检测 浓度为300 μg/ml的STW和ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞的细胞凋亡具有影响，有明显的诱导作用，与空白组对比，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

4 STW、ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞中Bax mRNA表达的影响 实验显示，白毛夏枯草提取物STW、ZTW均能促进肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中Bax mRNA的表达，其中乙酸乙酯提取物ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞中Bax mRNA表达的促进作用更为明显，同时呈现出一定的时间依赖性，见表4。

表3 流式细胞仪对肝癌细胞凋亡率检测(%)

表4 不同时间下STW、ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞中Bax mRNA表达的影响

讨 论

白毛夏枯草主要分布于我国秦岭以南各省份[4]，《本草纲目拾遗》记载：“叶梗同夏枯草，唯叶上有白毛，性寒、味苦、专清肝火”[5]。现代药理学研究发现[6-7]，白毛夏枯草的功效多样，例如抑菌、抗过敏、抗病毒以及增强免疫系统；其提取物可以止咳祛痰，降血压、保肝利胆等等。在临床应用中，含白毛夏枯草的复方药剂能够治疗慢性骨髓炎、抗肝炎、治疗高血压和慢性支气管炎等。近年来，国内外相关学者对白毛夏枯草在癌症领域研究报道逐渐增多[8-10]。本院通过实验探究白毛夏枯草的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)、对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的抑制作用和机制。相关研究显示，白毛夏枯草提取物可通过抑制肝癌细胞血小板衍生生长因子的表达来起到抗肝癌的作用[11]。在本实验中，通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度STW、ZTW对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的抑制增生作用，均取得了比较满意的效果。研究结果表明：不同白毛夏枯草提取物对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721均有较强的抑制作用，并且浓度越高，肝癌细胞分化越快，对肝癌细胞增生的抑制作用越明显，说明白毛夏枯草提取物对肝癌细胞的抑制有一定的浓度依赖性。研究显示，白毛夏枯草提取物可通过增加肝癌细胞凋亡基因的表达来诱导细胞的凋亡[12-13]。本实验运用流式细胞仪对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721凋亡率进行检测，通过检测发现浓度为300μg/ml的白毛夏枯草提取物STW、ZTW对HepG2和SMMC-7721细胞有明显的诱导其凋亡的作用，细胞凋亡率都在9%以上，与付晓瑞[14]研究结果相似。

本实验研究发现STW、ZTW均能促进HepG2和SMMC-7721细胞中的Bax mRNA的表达，并且时间越长，Bax mRNA表达增加的越多。提示HepG2和SMMC-7721细胞中的Bax mRNA的表达具有一定时间依赖性，STW、ZTW对肝癌细胞的抑制作用可能与Bax相关信号通路有关，与张娜[15]研究结果类似。西医治疗癌症不可避免的存在着各种副作用，而传统的中医药凭借着合理的价格和无任何毒副作用，已经受到越来越多的专业人士的重视。中药白毛夏枯草提取物可以通过抑制肝癌细胞增生，诱导细胞凋亡，抑制肝癌血管增殖，加速肝癌细胞分化等机制来抗肝癌。

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(收稿：2017-01-10)

Analysis of mechanism of anti-hepatoma different ajugadecumbens extractive

Wu Hang，Ling Xiaofeng.

Qinghai Hospital of TCM(Xining 810000)

Objective：To mechanism of anti-hepatoma ajugadecumbens water extractive and ethyl acetate extract as an example to explore the different extracts. Methods：The water extract of Herba Ajugae (STW), ethyl acetate extract (ZTW) respectively in HepG2 and SMMC-7721 in hepatocellular carcinoma cell lines. Using four methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the inhibitory effect of different concentration of STW, ZTW and SMMC-7721 on HepG2 cell proliferation, apoptosis and apoptosis of hepatoma SMMC-7721 cells induced by HepG2 under different concentrations of STW and ZTW were detected by flow cytometry, using one-step fluorescent RT-PCR (Real-time PCR) expression technique for the detection of the different concentrations of STW, ZTW and HepG2 after treatment of SMMC-7721 cells in Bax mRNA. Results ：STW and ZTW could significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 and SMMC-7721 cells, and inhibit the proliferation of hepatoma cells. The inhibitory mechanism of STW and ZTW was concentration dependent, and the inhibitory effect of ZTW was the strongest. Conclusion：Herba Ajugae water extract and ethyl acetate extract by inhibiting proliferation of hepatoma cells, induce cell apoptosis, inhibit vascular proliferation, accelerate cell differentiation mechanisms against liver cancer.

Ajugadecumbens Extractive Mechanism of anti-hepatoma

白毛夏枯草 提取物 抗肝癌机制

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.06.059