苏木乙酸乙酯提取物对心脏移植模型大鼠LFA-1mRNA表达的影响

史海蛟，杨可鑫

苏木乙酸乙酯提取物对心脏移植模型大鼠LFA-1mRNA表达的影响

史海蛟1，杨可鑫2

目的 观察苏木乙酸乙酯提取物对同种异位心脏移植急性排斥反应模型大鼠移植心肌淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)mRNA表达的影响，探讨其免疫抑制作用的机制。方法 采用改良的Ono术式，以Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，制备大鼠同种异位心脏移植模型，造模成功后，采用 Real Time-PCR法测定LFA-1mRNA的表达。结果 与模型对照组相比，苏木组、CsA组及苏木加半量CsA组均能明显抑制LFA-1mRNA的表达，而苏木乙酸乙酯提取物及苏木乙酸乙酯提取物加半量CsA抑制LFA-1 mRNA的表达的作用相当，且在抗排斥反应时，苏木乙酸乙酯提取物可以减少CsA的用量。结论 在大鼠心脏移植模型中，苏木乙酸乙酯提取物具有抑制同种异位心脏移植模型大鼠心肌的LFA-1mRNA的表达，减轻移植心脏的急性排斥反应。

苏木乙酸乙酯提取物；同种异体心脏移植；LFA-1mRNA

随着科学技术的飞速发展，同种异位器官移植已经是治疗终末期疾病器官移植相对有效的方法，而急性排斥反应是术后存活率和成败最大的障碍之一，有研究证实，移植排斥的效应阶段主要是宿主免疫细胞、炎症细胞大量浸润攻击移植物[1]。目前临床上已经应用了多种有显著效果的免疫抑制剂，但其毒副作用很大。因此，现在最主要的任务是如何使急性排斥的严重程度大幅度降低，寻找高效低毒、廉价的免疫抑制剂，是非常必要的。苏木为传统中药，具有祛瘀通经、活血疗伤的功效。文献有关于苏木功效的记载。《唐本草》首载：“主破血”。《大明》 ：“消臃肿，扑损淤血，排脓止痛”。在器官移植术后发生的急性排斥反应的主要病理表现是在受体血管与供体血管血流开通后数分钟内，供体血管迅速出现血栓形成，这与中医学的血瘀症较相似。中医治法则为活血化瘀。因此，苏木则应用于免疫抑制作用的研究。淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)是整合素家族中的一个成员，是细胞间黏附因子-1(ICAM-1)的配体，能增强细胞毒性T细胞和NK细胞的杀伤效应。研究发现黏附分子参与排斥反应中免疫系统的激活，阻断黏附分子活性能明显延长移植物的生存时间。因此，本文研究旨在通过建立大鼠心脏移植急性排斥反应模型，观察苏木乙酸乙酯提取物对同种异位心脏移植急性排斥反应模型大鼠移植心肌LFA-1mRNA表达的影响，探讨其免疫抑制作用的机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及样品采集

1.1.1 实验动物 受体：健康、清洁级SD大鼠，雄性，体重(220±20)g。供体：健康、清洁级Wistar大鼠，雄性，体重(220±20)g。均由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 实验用药 苏木乙酸乙酯提取物：苏木粗粉(80目)加入 75%乙醇回流提取2 h，提取液减压回收乙醇，浓缩至膏状，减压干燥，得到干粉。将苏木乙醇提取干粉倒入双蒸水进行混悬，并用乙酸乙酯萃取、回收，从而获得苏木乙酸乙酯提取物。环胞素A(CsA)：将每粒含CsA 25 mg的环孢素软胶囊(田可)溶解于橄榄油中，将其配制成3.5 mg/mL浓度的药液，于4 ℃环境中保存备用。

1.1.3 心脏移植模型的制备 大鼠同种异位心脏移植术，采用经改良的Ono术式，将供心的升主动脉与受体的腹主动脉，供心的肺动脉与受体的下式，将供心的升主动脉与受体的腹主动脉，供心的肺动脉与受体的下腔静脉分别吻合，为供心提供血液循环。

1.1.4 实验分组 大鼠随机分为4组，每组8只。设为模型对照组、苏木组、CsA组、苏木加半量CsA组。术后每天09：00灌胃给药，每天1次，模型对照组每天按10 mL/ kg灌服橄榄油，苏木组给予苏木乙酸乙酯提取物736 mg/kg溶于橄榄油后灌服给药，CsA组给予按35 mg/kg溶于橄榄油后灌服给药，苏木加半量CsA组给予苏木乙酸乙酯提取物736 mg/kg加CsA 17.5 mg/kg溶于橄榄油后灌服给药，各组均以同体积橄榄油给大鼠灌胃。

1.1.5 标本的采集 术后大鼠腹腔移植心跳满7 d者于当天取供心；不满7 d者于腹腔心脏停跳时取供心。移植心脏存活时间以天为计算单位，手术当天按0 d计算，不足24 h者采用四舍五入法计算。术后第7天，给药2 h后，将受体大鼠用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg体重)麻醉，常规固定、消毒、铺巾处理。沿正中线切开腹壁，剥离出下腔静脉。快速用手术剪(0.1 %DEPC 水处理后)剪取供心心肌组织，标本分为两份：一份剪碎后置入冻存管中，迅速置于液氮罐中冷冻，-80 ℃低温冰箱保存，待做Real-Time PCR检测用。

1.2 Real Time PCR测定LFA-1mRNA

1.2.1 总RNA的提取 提取RNA按照美国QIAGEN公司RNeasy@ Mini Kit试剂盒的说明进行操作：取样品100 mg放入预冷的研钵中，加入液氮研磨，将粉末移入1.5 mL EP管中，加入450 μL Buffer RLT；将样品转移至2 mL体积的RNeasy column中，大于8 000 g/min，离心15 s，弃上清。然后加700 μL Buffer RW1到RNeasy column中，大于8 000 g/min，离心15 s，弃上清。再加500 μL Buffer RPE到RNeasy column中，大于8 000 g/min，离心15 s，弃上清。加500 μL Buffer RPE到RNeasy column中，大于8 000 g/min，离心2 min。将RNeasy column移至一新的2 mL EP管中，10 000 g/min，离心1 min。将RNeasy column移至一新的1.5 mL EP管中加入30 μL～50 μL RNase-free水，大于8 000 g/min，离心1 min。弃柱子，溶液-20 ℃保存。将取提取的Total RNA，用紫外分光光度计检测在260 nm和280 nm下的OD值，260 nm/280 nm 的比值应在1.8～2.0范围内。小于1.8说明有蛋白污染，大于2.0则可能有机溶剂污染。

1.2.2 引物设计(见表1)

表1 引物设计

1.2.3 纯度验证 将提取的RNA进行甲醛变性凝胶电泳，对其纯度加以验证，方法如下：电泳槽用0.3%H2O2浸泡30 min，0.1%的DEPC水冲洗晾干后铺胶(20 mL)∶1.2%的琼脂糖0.24 g，无RNase水17.4 mL，10×MOPS 2.0 mL，37%甲醛0.6 mL，DNA Green 1.0 μL将琼脂糖加水融化后，加10×MOPS，待胶冷却至60°C左右，再加甲醛和DNA Green。加入2.0 mL甲醛凝胶上样缓冲液(10×)进行上样和电泳：稳压7.5 V/cm电泳。

电泳液为1×MOPS电泳缓冲液。直至溴酚蓝迁移至胶下游的3/4处时，结束电泳，在紫外投射仪下，测量28S rRNA和18S rRNA至加样孔的距离，用来确定RNA的完整性。完整的总RNA样品应出三条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应为18S rRNA条带亮度的3倍左右，这表明总RNA样品比较完整，基本无降解。1.2.4 反转录反应 按照TaKaRa PrimeScript ® RT-PCR Kit反转录试剂盒使用说明进行操作。

1.2.5 Real Time PCR 反应 使用SYBR®Green I嵌合荧光法检测各组基因的表达。按Power SYBR® Green PCR Master Mix： Performing Real-Time PCR Assays(For Applied Biosystems，ABI 7500，Invitrogen Tech-Line SM U.S.A. PN 4367218)和ROX Reference Dye (Invitrogen Tech-Line SM U.S.A. Cat. No. 12223-012)试剂盒的组分配制Real-time PCR反应液(在冰上进行反应液配制)

1.2.6 计算方法 在60 ℃、60 s步骤收集信号，调整最佳阈值，获得Ct值；同时对Real-time PCR产物进行SYBR融解曲线分析，并用灭菌的去离子水代替模板作为阴性对照。以β-actin 作为内参照，用相对定量法2-ΔΔCt分析mRNA相对表达量。ΔΔCt=[对照组目的基因平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值]-[待检样品目的目的基因平均Ct值-待检样品看家基因平均Ct值]。

2 结 果

从溶解度曲线可见看出，溶解曲线只有一个峰，说明PCR扩增特异性良好(见图1)。从标准曲线可以看出，β-actin和LFA-1mRNA扩增效率基本一致，说明结果可靠(见图2)。以模型对照组大鼠作为对照，其LFA-1mRNA表达量为1，随着药物的干预，各治疗组LFA-1mRNA表达降低，与模型对照组比较，各治疗组均能明显抑制LFA-1mRNA的表达，差异有统计学意义(P<0.01)；与CsA组比较，苏木组作用效果较差，差异有统计学意义(P<0.05)，而苏木加半量CsA组作用效果相当，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

图1 Real Time-PCR扩增基因β-actin和LFA-1的溶解曲线

图2 Real Time-PCR扩增基因β-actin和LFA-1的标准曲线

表2 移植心肌组织LFA-1mRNA相对表达(±s)

3 讨 论

LFA- 1 最初是在CTL介导靶细胞杀伤实验中发现的，功能与CTL相关的膜蛋白分子。LFA-1属于整合素家族的一类黏附分子，能表达于淋巴细胞及中性粒细胞等表面，与细胞内黏附分子ICAM(1-3)结合(其中LFA-1与ICAM-1结合力最强)，引起细胞内产生一系列的信号转导，从而介导白细胞的黏附、游走及吞噬等功能[2]。牛坚等[3]研究认为，VCAM-1参与单核/巨噬细胞和淋巴细胞向炎症部位浸润和NK细胞黏附与迁移，异种肝移植急性排斥反应时，LFA-1mRNA表达明显升高，VCAM-1的表达明显升高。若能明显抑制异种肝移植排斥反应中LFA-1mRNA的表达，则可有效抑制移植排斥反应。研究表明，LFA-1mRNA参与中性粒细胞与血管内皮黏附并穿越血管内皮过程，参与T淋巴细胞的活化过程，并可调节多种细胞因子的分泌[4]。而介导白细胞向移植部位的浸润是LFA-1mRNA参与排斥反应发生的机制之一，而且能启动T淋巴细胞的黏附和活化，攻击带有移植物抗原的靶细胞，增强急性排斥反应程度[5]。此外，还有研究表明，阻断LFA-1mRNA的结合位点可抑制移植排斥反应。而动物体内实验[6]的研究表明，LFA-1mRNA单克隆抗体能明显延长移植鼠的生存期，并且能显著降低急性移植物抗宿主(graft-versus-host disease，GVHD)的发生。Dedrick 等[7]在肾移植方面的研究得到相似结果。欧洲多中心开展的Ⅱ期临床研究发现，应用LFA-1 mRNA抗体阻断LFA-1/ICAM-1协同刺激信号虽然可降低GVHD的发生率，提高移植成功率，但同时造成了持续免疫抑制，增加严重感染率和白血病复发率，致使人类白细胞抗原(HLA)不相合异基因造血干细胞移植的远期生存率无明显增加[8]。

本实验研究结果发现，与模型对照组比较，苏木组和CsA均能降低移植心肌中LFA-1 mRNA 及蛋白的表达。苏木加半量CsA组对LFA-1mRNA的降低作用好于苏木组，略低于CsA组，但二者无明显差异。因此，一方面说明LFA-1mRNA参与了SD大鼠的心脏移植排斥反应；另一方面也更进一步说明苏木是通过调节LFA-1mRN发挥的作用，而在抗排斥方面，苏木可减少CsA的用量。可见，苏木乙酸乙酯提取物能明显改善术后大鼠的一般状态，其作用机制可能与苏木乙酸乙酯提取物能抑制LFA-1mRNA的表达有关，但其抗免疫排斥作用的另一些机制还有待进一步研究。

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(本文编辑郭怀印)

国家重大科技专项(No.2009ZX09103-425)

1.辽宁中医药大学附属医院(沈阳110032)，E-mail：80670335@163.com；2.辽宁中医药大学

信息：史海蛟，杨可鑫.苏木乙酸乙酯提取物对心脏移植模型大鼠LFA-1mRNA表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(10)：1183-1186.

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.10.010

1672-1349(2017)10-1183-04

2017-01-06)