参地补肾胶囊对高糖培养的肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表达的影响

周美馨,李淑菊,张琪*

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

参地补肾胶囊对高糖培养的肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表达的影响

周美馨1,李淑菊2,张琪2*

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036)

目的：观察参地补肾胶囊对高糖培养下肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA表达的影响，探讨参地补肾胶囊抗肾间质纤维化的作用机制。方法：以高糖培养的人肾小管上皮细胞作为研究对象，采用血清药理学研究方法和Real-time PCR检测技术，观察空白对照组、高糖模型组、参地补肾胶囊组和贝那普利组的TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA的表达，采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。结果：高糖培养下的人肾小管上皮细胞TGF-β1、α-SMA mRNA的表达与空白对照组比较明显增加(P<0.05)，E-cadherin mRNA的表达与空白对照组比较明显降低(P<0.05)；参地补肾胶囊组能够下调肾小管上皮细胞对TGF-β1、α-SMA mRNA的表达，上调E-cadherin mRNA的表达，与高糖模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：本研究表明参地补肾胶囊通过下调高糖刺激的人肾小管上皮细胞对TGF-β1、α-SMA mRNA的异常表达，上调E-cadherin mRNA的异常表达，从而发挥抗肾间质纤维化的作用。

参地补肾胶囊；肾间质纤维化；肾小管上皮细胞；TGF-β1；α-SMA；E-cadherin

肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis,RIF)是由于各种原发或继发性慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)(如原发性肾小球疾病、高血压肾损害、糖尿病肾病、自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮肾病、急慢性间质性肾炎等)持续发展，导致细胞外基质在肾间质处过度沉积，将肾脏正常组织结构取代，肾小管发生变形、萎缩，以致周围肾小管毛细血管数锐减，造成肾脏功能发生不可逆的受损。RIF是终末期肾脏疾病(End stage renal disease,ESRD)的共同病理表现，其主要病理特征是肾小管发生萎缩、肾间质处成纤维细胞过度增生以及细胞外基质的过度聚集[1]。RIF和肾小球硬化均会发生肾功不全而造成CKD，但就其减退的相关性而言，RIF与肾功能减退呈显著正相关；能够准确地预测判断肾功能恶化的程度，决定CKD的预后[2-5]。参地补肾胶囊临床上应用于治疗慢性肾功能衰竭，能够改善患者肾功能，调节脂代谢，提高肾小球滤过率，具有一定的抗肾纤维化的作用[6]。本研究采用血清药理学研究方法，以高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞为实验模型，选取TGF-β1、α-SMA、E-cadherin为研究对象，探讨参地补肾胶囊改善肾间质纤维化的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞

HK-2正常人近端肾小管上皮细胞株购于中科院上海细胞库。

1.2 实验动物

健康雄性SD大鼠40只，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，体质量(200±20)g，动物许可证号：SCXK(黑)2016005。

1.3 试剂及药品

参地补肾胶囊(黑龙江省中医研究院生产，产品批号：黑药制字Z20100039。由人参、茯苓、白术、熟地黄、草果仁、大黄、红花、赤芍、丹参等药物组成)；盐酸贝那普利片(北京诺华制药公司生产，批准文号：H200130513)；K-SFM、胎牛血清及二甲基亚砜(上海中科院)；D-葡萄糖(Sigma公司)；胰蛋白酶及EDTA(Haigene公司)；TRIzol试剂(博仕公司)；PCR定量试剂盒(博仕公司)；PCR引物合成(博仕公司)；TGF-β1 antibody、Anti-E Cadherin antibody和α-SMA Muscle antibody(Sigma公司)；鼠抗β-actin单克隆抗体(金斯瑞公司)。

1.4 仪器设备

二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo);离心机(上海安亭，TGL-16GB);水平电泳槽(北京六一，DYCP-31BN);凝胶成像系统(UVP，UVP-200);PCR仪(MJ，PTC200);荧光定量PCR仪(MJ，Mini-Opticon2);超低温冰箱(中科美菱，DW-HL328)。

2 实验方法

2.1 制备含药血清

将40只雄性大鼠，称体质量编号后，采用随机数字表法随机分成4组(每组10只)，即空白对照组、高糖模型组、参地补肾胶囊组、贝那普利组。根据“人和动物的体表面积等效剂量比值表”分别给予参地补肾胶囊组按0.324 g/(kg·d)灌胃给药，贝那普利组给予0.9 mg/(kg·d)灌胃给药，正常组给予等体积生理盐水，各组每日等体积灌胃2次，自由饮水，连续给药7 d。于末次给药2 h后，行眼颈总动脉取血，将血液迅速加入离心管混匀，于室温静置1 h，再置于4℃环境中静置1 h，置于离心机，以3 000 r/min的转速离心10 min，分离出血清，将同组的不同大鼠血清混匀，置于56℃的水浴锅中，行补体灭活30 min，在无菌超净台上使用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌2次，无菌过滤后进行分装入管，置于-80℃冻存备用。

2.2 细胞培养及分组

用含10%胎牛血清的K-SFM培养基培养HK-2细胞，待细胞生长融合至70%～80%时，以每孔板1×104mL密度转种至细胞培养板上，于37℃、5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰酶消化，培养7 d以1∶2比例进行传代。以无血清培养基饥饿培养细胞24 h，使细胞同步化，分成4组：(1)空白对照组：10%正常大鼠血清+K-SFM培养液；(2)高糖模型组：10%正常大鼠血清+25mmol/L D-葡萄糖+K-SFM培养液；(3)参地补肾胶囊组：10%参地补肾胶囊大鼠含药血清+25 mmol/L D-葡萄糖+K-SFM培养液；(4)贝那普利组：10%贝那普利大鼠含药血清+25 mmol/L D-葡萄糖+K-SFM培养液。

2.3 Real-time PCR检测各组细胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的表达

2.3.1 RNA的提取

取对数生长、贴壁融合达到80%的HK-2细胞，进行同步化24 h后，根据实验分组，向每个培养孔中加入1 mL Trizol溶液，静置5 min，加入200 μL三氯甲烷，反复颠倒混匀15 s，再于室温静置5 min。4℃下，应用13 000 rpm转速的离心机进行10 min的离心。轻轻吸取上清液，加入约600 μL等量的异丙醇，混匀充分后再放置-20℃冰箱静置10 min。于4℃下，应用13 000 rpm转速的离心机进行10 min的离心，弃去上清，加入已经预冷的75%的乙醇1 mL。4℃，13 000 rpm离心5 min，弃上清；室温干燥沉淀5～15 min，加入30 μL RNase Free H2O进行吹打，加入2×RNA Loading Buffer，65℃变性10 min。

2.3.2 cDNA的合成

置于冰上的PCR管中加入配置好的逆转录反应体系(RNA 1 μg，20×Oligo dT(25)&Random Primer 1 μL，5×Golden RT MasterMix 4 μL，Rnase Free H2O 14 μL，总体积达20 μL)，瞬时离心，去除基因组DNA。将反应液放置在PCR仪器上，在30℃反应变性5 min→55℃反应30 min合成cDNA→85℃ 10 min灭活逆转录酶，使模板cDNA变性→将所得的变性cDNA从PCR仪中取出，并按照一定的比例稀释，于4℃保存备用。

2.3.3 引物设计与合成

应用引物设计软件Primer 6.0进行引物设计与合成。TGF-β1引物序列为：5′-CGACTCGCCAGAGTGGTTAT-3′,5′-AGTGAACCCGTTGATGTCC-3′，长度151 bp。α-SMA引物序列为：5′-GAAGAGTTACGAGTTGCCTGATG-3′,5′-ATGATGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3′，长度138 bp。E-cadherin mRNA引物序列为：5′-GCTGGACCGAGAGAGTTTCC-3′,5′-CAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3′，长度155 bp。Human actin引物序列为：5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′,5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA。

2.3.4 定量PCR测定TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的表达

以β-actin为内参基因测定TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表达。在PCR扩增体系中，依次加入5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL、PCR Forward Primer(10 μM) 0.8 μL、PCR Reverse Primer(10 μM) 0.8 μL、cDNA 2 μL、dd H2O 12.4 μL。将上述液体混匀，加入PCR反应管中，置于Bio-Rad Min-Opticon2定量PCR仪内，设置好反应条件后进行扩增。反应条件：95℃进行预变性15 min，95℃变性45 s→95℃退火10 s→60℃延伸30 s，共45个循环。最后一次，72℃延伸5 min。反应结束后，采集荧光信号，以β-actin基因表达量作为内参，采用Quantity one软件对电泳条带进行分析，进行半定量矫正(各基因条带吸光度值与β-actin的吸光度值之比)，数据分析采用CT法，计算出每份样品中TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的相对表达含量。

2.4 统计学处理

实验数据运用SPSS19.0统计学软件进行处理统计分析，所有实验计量资料均以“均数±标准差”表示，方差齐者，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 参地补肾胶囊对HK-2细胞TGF-β1 mRNA的影响

模型组细胞TGF-β1 mRNA的表达明显高于正常组，与空白组比较，有显著性差异(P<0.05)；参地补肾胶囊组、贝那普利组的TGF-β1 mRNA表达低于模型组，与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)。说明高糖模型组细胞TGF-β1 mRNA表达量增加，而参地补肾胶囊能够显著下调TGF-β1 mRNA的表达。结果见表1。

表1 各组培养基对高糖诱导HK-2细胞TGF-β1 mRNA表达的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05；与高糖模型组比较,△P<0.05

3.2 参地补肾胶囊对HK-2细胞α-SMA mRNA的影响

模型组细胞α-SMA mRNA的表达明显高于正常组，与空白组比较，有显著性差异(P<0.05)；参地补肾胶囊组、贝那普利组的α-SMA mRNA表达低于模型组，与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)。说明高糖模型组细胞α-SMA mRNA表达量增加，而参地补肾胶囊能够显著下调α-SMA mRNA的表达。结果见表2。

3.3 参地补肾胶囊对HK-2细胞E-cadherin mRNA的影响

模型组细胞E-cadherin mRNA的表达明显低于正常组，与空白组比较，有显著性差异(P<0.05)；参地补肾胶囊组、贝那普利组的E-cadherin mRNA表达高于模型组，与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)。说明高糖模型组细胞E-cadherin mRNA表达量减少，而参地补肾胶囊能够显著上调E-cadherin mRNA的表达。结果见表3。

表2 各组培养基对高糖诱导HK-2细胞α-SMA mRNA表达的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05；与高糖模型组比较,△P<0.05

表3 各组培养基对高糖诱导HK-2细胞E-cadherin mRNA表达的影响

注：与空白对照组比较,*P<0.05；与高糖模型组比较,△P<0.05

4 讨论

中医古籍并无“肾间质纤维化”这一病名，根据其病因病机以及相关的临床表现，将其归属于“关格”“腰痛”“虚劳”“肾风”等范畴。RIF演变过程，与肺、脾、肾三脏虚损及三焦气化失职有关，尤其脾肾虚损是贯穿整个RIF病机。脾肾二脏，一为人体先天之本，一为人体后天之本，二者相互滋生为用，筑成人体生命之基石。肾为藏精泻浊之本体，若肾气虚损，则其开阖失司，使浊邪难以下泻；脾为水谷运化之总司，若脾气受损，则健运失司，水湿内停。脾肾虚衰则脾失固涩，肾失封藏，升清降浊功能紊乱，致水湿内蕴，日久湿浊蕴积，血行不畅，阻遏气机，瘀血与湿浊毒邪胶着，滞于肾脏，发为此病。参地补肾胶囊具有补益脾肾，清化湿浊，解毒活血之功，方中熟地黄、大黄、人参为君药；桃仁、丹参、赤芍、草果仁为臣药；淫羊藿、菟丝子、茯苓、红花、白术为佐药；半夏、黄连、甘草为使药。

肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病持续进展的共同结果，其形成机制复杂，是由多种细胞、细胞因子、炎症介质等诸多因素共同参与作用的结果，与成纤维细胞的增生密切相关，进而导致细胞外基质降解减少，合成增多，使间质成分纤维化变性[7-8]。肾间质纤维化形成的主要机制是由于肾小管上皮细胞发生的转分化，形成肌成纤维细胞。在众多的细胞因子中，转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)被认为和组织纤维化发生、发展、转归密切相关，是导致细胞外基质积聚的重要生长因子。研究发现，在不同程度的RIF中，TGF-β1均呈现高度表达，在RIF的形成中全程参与、启动并调控上皮间质转分化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，被认为是治疗RIF最为理想的作用靶点[9-12]。而α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)作为肌成纤维细胞的标志蛋白，是肾小管上皮细胞向间质细胞转化的标志性蛋白，是细胞外基质合成的主要来源[13]。肾间质纤维化发生过程中，各类生长因子、炎性因子等多种活性物质诱导肾间质成纤维细胞以及肾小管上皮细胞等发生表型转化，转化为α-SMA阳性的肌成纤维细胞，使细胞外基质过度积聚，在肾纤维化的发生发展中起关键作用[14]。各种肾脏疾病中α-SMA的高表达，是纤维细胞受损激活和表型转化的标志，同时作为阳性的肌成纤维细胞的特异性标志蛋白，是预测肾纤维化进展的理想指标[15-16]。上皮钙黏蛋白(Epithelial-cadherin，E-cadherin)广泛分布于上皮组织中，在正常的肾小管上皮细胞中呈现高表达[17]。当肾脏损伤时，E-cadherin的含量减少，使细胞间的黏附功能受损，细胞形态发生变化，从而启动EMT过程，使上皮细胞向间质细胞转化，继而发展为肾间质纤维化。

本研究显示，高糖模型组的TGF-β1、α-SMA mRNA的表达较空白对照组明显增加，E-cadherin mRNA的表达较空白对照组明显减少，说明高糖成功的诱导了肾间质纤维化的发生；而参地补肾胶囊能够抑制α-SMA mRNA的表达，增强E-cadherin mRNA的表达，说明参地补肾胶囊能够拮抗高糖诱导的EMT，减轻肾小管上皮细胞损伤；参地补肾胶囊还能够抑制TGF-β1 mRNA的表达，说明参地补肾胶囊通过下调TGF-β1 mRNA的表达，抑制转分化的发生，从而阻抑肾间质纤维化的发生。

综上所述，参地补肾胶囊通过降低TGF-β1、α-SMA mRNA的表达，增强E-cadherin mRNA的表达，减轻肾小管上皮细胞损伤，抑制转分化的发生，减轻肾间质纤维化，从而起到保护肾脏的作用。

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2016-10-08

2016-12-05

周美馨(1986-)，女，博士研究生，主要研究方向：中医药治疗肾病的研究。

*通讯作者：张琪(1922-)，男,首届国医大师，博士研究生导师，主要研究方向：中医药治疗肾病的研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0020-04