知柏地黄丸中知母对阳离子牛血清白蛋白大鼠膜性肾炎的作用研究

明继阳，丁彦，李洋，王知斌，匡海学，王秋红

(1.黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学，广东 广州 510006)

知柏地黄丸中知母对阳离子牛血清白蛋白大鼠膜性肾炎的作用研究

明继阳1，丁彦1，李洋1，王知斌1，匡海学1，王秋红2*

(1.黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040；2.广东药科大学，广东 广州 510006)

目的：探讨知柏地黄丸中知母对大鼠膜性肾炎慢性肾炎的治疗作用。方法：将大鼠分成空白组、模型组、知柏地黄丸组和无知母知柏地黄丸组，采用阳离子牛血清白蛋白大鼠膜性肾炎模型，观察大鼠尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、总胆固醇生化指标，及肾脏病理切片HE染色后的病理形态。结果：知柏地黄丸组在给药4周后，大鼠尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、总胆固醇及组织形态的改善效果与模型组比有极显著性差异，并优于无知母知柏地黄丸组。结论：知柏地黄丸中知母有治疗大鼠慢性膜性肾炎的作用，方剂中配伍知母，提高治疗效果，知母发挥其滋阴补肾作用。

知母；知柏地黄丸；大鼠肾炎模型

知柏地黄丸出自《医宗金鉴》，由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮、知母和黄柏等组成。方中熟地黄为君药，滋阴补肾，益精填髓。知母甘，寒，清虚热、滋肾阴；黄柏苦，寒，泻虚火、坚真阴，配合熟地黄以滋阴降火，诸药配合，具有滋阴降火之功效，主要用于阴虚火旺、潮热盗汗、口干咽痛、耳鸣遗精、小便短赤等证[1-3]。本文以知母为研究对象，采用阳离子牛血清白蛋白的大鼠肾炎模型[4-7]，来研究知母在知柏地黄丸中的滋阴补肾作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验仪器

CITOGLAS粘附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)；722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；LXJ-Ⅱ离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；moticam3000美国显微摄影成像系统(美国motic公司)。

1.3 实验试剂

尿蛋白定量试剂盒、血肌酐测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒、甘油三酯测定试剂盒生产于南京建成生物工程研究所，阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)制备，参照改良Border法[4]进行制备。

1.4 药材及药品制备

知母产地为河北省，黄柏产地为四川省，山茱萸产地为山西省，熟地产地为河南省，泽泻产地为辽宁省，山药产地为河北省，茯苓产地为云南省，牡丹皮产地为安徽省，于齐齐哈尔仙鹤中药饮片加工厂加工。

1.4.1 知母浸膏的制备

取2.5 kg知母饮片，用10倍量的蒸馏水浸泡12 h，然后用14倍量的水提取，沸腾2 h后，再用12倍量的水提取第2次，沸腾2 h后合并提取液并浓缩干燥。

1.4.2 无知母知柏地黄浸膏的制备

按照知柏地黄丸组方配比，取黄柏、山茱萸、熟地黄、泽泻、山药、茯苓和牡丹皮，根据药典按照2∶4∶8∶3∶4∶3∶3的比例制备。用10倍量的水浸泡4 h。用14倍量的水提取2 h，共提取2次，合并提取液并浓缩干燥。

1.5 实验方法

将大鼠随机分成4组，即空白组、模型组、知柏地黄丸组、无知母知柏地黄丸组(以下简称无知母组)，每组6只。

1.5.1 模型制备

预免疫：大鼠适应实验环境1周，进行预免疫，尿蛋白呈阴性的大鼠作为实验大鼠，预留6只作空白对照，其余大鼠进行预免疫。除空白对照组外，给予大鼠腹股沟及腋窝等处进行多点皮下注射，每只大鼠给予0.3 mL乳化物且每点注射不超过0.05 mL(将80 mgC-BSA溶于15 mLPBS中，与等量弗氏不完全佐剂混合)。正常对照组则以PBS与弗氏不完全佐剂混合进行预免疫[5-9]。

正式免疫：预免疫1周后，每次将C-BSA溶于1 mLPBS中进行尾静脉注射，首次C-BSA尾静脉注射量为3.5 mg/只，隔日1次，每周3次，6周内缓慢将注射量递增至5 mg/只，正常对照组注射同体积的PBS[10-13]。

1.5.2 给药与分组

根据人与大鼠给药剂量折算比给药，实验于造模第4周开始灌胃给药，每日1次。空白组与模型组为对照组，灌胃生理盐水。无知母知柏地黄丸组灌胃无知母知柏地黄丸浸膏，知柏地黄丸组灌胃知柏地黄丸浸膏溶液。

1.5.3 指标考察

①24 h尿蛋白定量

分别于实验前、正式免疫后第3周末、4周末、5周末、6周末、7周末及8周末将大鼠放入金属代谢笼中，测24 h尿蛋白含量。

②血生化检查

实验结束后，麻醉大鼠取血，全自动生化分析仪测定总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、血清肌酐(SCR)等3项生化指标。

③HE染色

实验结束后，采用体内灌注法取材作光镜检查。石蜡包埋，常规切片，将切片放入二甲苯中脱蜡，再放入乙醇中梯度水化，用苏木素和伊红依次染色，在光学显微镜下观察。

2 实验结果

2.1 尿蛋白定量

实验对第0、3、4、5、6、7、8周测24 h尿蛋白定量值，结果见表1。

表1 24 h尿蛋白定量比较

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与无知母组比较,△P<0.05，△△P<0.01

模型组与空白组比较，有显著性差异，造模成功。无知母知柏地黄丸与模型组比较，第6～8周有显著性差异(P<0.05)。知柏地黄丸与模型组比较，第4～5周与其有显著性差异(P<0.05)，在第6～8周与起比较，与其有极显著性差异(P<0.01)。与无知母知柏地黄丸比较，第4周与其有显著性差异(P<0.05)，第5～8周与其有极显著性差异(P<0.01)。

2.2 大生化指标测定

表2 对大鼠血清中肌酐、甘油三酯、总胆固醇水平的影响

注：与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01；与无知母组比较,△P<0.05，△△P<0.01

见表2。与空白组比较，模型组各项指标与其有显著性差异(P<0.05)。知柏地黄丸组，与模型组比较，血清中肌酐、甘油三酯和总胆固醇有极显著性差异(P<0.01)；与无知母知柏地黄丸对比，甘油三酯与其有极显著性差异(P<0.01)。

2.3 HE染色检查结果

空白组肾小球形态正常，模型组肾小球体积增大，球囊间隙增宽，肾小球毛细血管呈开放状态，管壁明显增厚，染色增强(嗜酸性增强)，毛细血管球呈分叶状。知柏地黄丸组治疗后，与模型组相比，肾小球毛细血管开放明显减少，甚至与空白组开放程度相似，肾小球囊腔减小，毛细血管球未分叶，染色程度弱，其HE染色检查结果优于无知母知柏地黄丸组，最接近空白组；见图1。

图1 光镜下肾脏组织病理变化A.空白组;B.模型组;C.知柏地黄丸组;D.无知母知柏地黄丸组

3 讨论

3.1 大鼠膜性肾炎模型的选择与建立

本实验采用C-BSA制备大鼠膜性肾炎模型，是基于循环抗体与外来植入性抗原结合形成原位性免疫复合物的理论建立的[6]。免疫复合物沉积于上皮使肾小球基底膜中，使滤过孔径变大，使肾小球基底膜(GBM)阴离子屏障破坏。模型建立后尿蛋白、血肌酐及血尿素氮显著升高，肾组织病理检查肾小球呈典型膜性改变，毛细血管壁增厚，在上皮有嗜复红物沉积，与膜性肾炎改变一致。

3.2 对膜性肾炎大鼠24 h尿蛋白的影响

膜性肾炎是典型的免疫复合物型慢性肾炎，大量的蛋白尿是其主要的病理特征。蛋白尿大量的原因，一方面是免疫复合物沉积改变肾小球基底膜中分子的结构，增大滤过孔径，使较大分子的蛋白物质可以自由通过；另一方面是电荷性质的改变，破坏GBM阴离子屏障，使带负电荷的白蛋白能够自由通过而产生蛋白尿。

尿蛋白的反复持续存在对肾脏组织以及全身有很大的影响。尿蛋白能直接损伤肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞；促使成纤维细胞及肾小管上皮细胞合成分泌细胞外基质(ECM)，并抑制ECM的降解，产生大量的ECM沉积，导致肾间质纤维化，引起肾小球硬化并使肾小球受损，致使肾功能低下，因此改善蛋白尿症状具有重要意义。

本实验结果表明，知柏地黄丸组与模型组比从4周起效，6～8周有显著性效果，而无知母知柏地黄丸组在6周开始起效，知柏地黄丸组在第4周开始治疗效果优于无知母知柏地黄丸组。说明知母在肾炎的治疗中发挥作用，可能有减少免疫复合物沉积的作用，减轻肾小球基底膜结构损伤和电荷性质的改变，减少尿蛋白的排出，恢复肾小球滤过功能，减少其尿蛋白的排出。

3.3 对膜性肾炎大鼠血清中SCR、TG、T-CHO的影响

血清中CRE的含量是反映肾小球滤过功能的指标，其血清浓度由机体对氮的分解代谢能力和肾脏的排泄能力决定，血清肌酐不受肾脏以外因素影响，是判断肾小球的滤过功能的关键指标。

在肾病综合征病理中，严重的蛋白尿可导致低蛋白血症，低蛋白血症可降低血浆渗透压，刺激肝细胞合成脂蛋白升高，引起脂质代谢紊乱，进而产生高脂血症[14]。高脂血症是肾脏病变发展过程中的重要病理变化之一。其可直接损伤肾血管，诱导多种细胞因子及组织内酶的表达异常并引起肾小球硬化及肾小管间质的纤维化[15]。

本实验结果显示，模型组的SCR、T-CHO、TG明显高于正常对照组，药物治疗后，知柏地黄丸组SCR、T-CHO、TG与模型组相比有显著差异(P<0.05)，并且优于无知母知柏地黄丸，提示知母可能有改善肾小球滤过率、促进损伤组织的修复的作用，同时改善膜性肾炎的高血脂症状，可能与其降低尿蛋白排出有关。

综上所述，通过观察知柏地黄丸给药前后影响大鼠膜性肾炎的生理指标和病理形态，发现知柏地黄丸治疗效果佳，说明知母有改善肾功能和肾小球滤过率、促进损伤组织的修复的作用，治疗大鼠膜性肾炎的作用，进一步证实中医理论中知柏地黄丸取知母滋阴补肾之作用，为中医辨病论治合理用药提供科学依据。

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The effect ofRhizomaAnemarrhenaein Zhibai Dihuang Pill on Membranous Nephritis Rats Caused by cBSA

MING Ji-yang1, DING Yan1, LI Yang1, WANG Zhi-bin1, KUANG Hai-xue1, WANG Qiu-hong2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective:To study the treatment effect ofRhizomaAnemarrhenae(Zhi Mu) in Zhibai Dihuang pill on membranous nephritis. Methods:The rats were divided into the blank group, the model group, the observation group(Zhibai Dihuang pill) and the control group(Zhibai Dihuang pill without Zhi Mu). The membranous nephritis model was established with cationic bovine serum album(cBSA). The biomedical indicators, such as urinary protein, serum creatinine, total cholesterol(TC), and triglyceride(TG) were tested, and histomorphology of the kidney was observed in rats. Results: The observation group could significantly improve the levels of biomedical indicators and glomerular vessel status compared to the model group after four-week treatment, which was better than the control group. Conclusion: Zhi Mu has good effects on membranous nephritis rats in Zhibai Dihuang pill, with its action of nourishing yin and tonifying the kidney.

RhizomaAnemarrhenae; Zhibai Dihuang pill; Nephritis rat model

2016-09-04

2016-12-28

国家自然科学基金面上项目(81274103)

明继阳(1982-)，女，博士研究生,主要从事中药化学专业复方研究工作。

*通讯作者：王秋红(1969-)，女，教授，博士生导师，主要从事中药炮制研究，中药药效物质基础研究和新药开发工作。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0048-04