肝气郁结证致ED大鼠模型建立的实验研究

王丽，张星平,2，王万舜，曾焰灿，张欢，阿斯亚木·木沙江

(1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学国家十二五中医各家学说重点学科,新疆 乌鲁木齐 830000)

肝气郁结证致ED大鼠模型建立的实验研究

王丽1，张星平1,2，王万舜1，曾焰灿1，张欢1，阿斯亚木·木沙江1

(1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学国家十二五中医各家学说重点学科,新疆 乌鲁木齐 830000)

目的:建立肝气郁结型阳痿病证大鼠模型，并评价模型的可行性。方法:采用复合情志刺激法施予刺激，建立大鼠肝气郁结证候模型。观察大鼠生物学表征，判定证候模型建立后，通过性行为学交配实验及APO勃起功能实验比较对照组、肝郁组大鼠的性行为变化。结果:(1)生物学表征：肝郁组生物学表征改变符合中医临床证候特点，且表现随造模周期的延长逐渐加重。(2)性行为学交配实验：肝郁组大鼠的爬背潜伏期、插入潜伏期、射精潜伏期较对照组大鼠均有所延长(P<0.05)，而爬背次数、插入次数、射精次数较正常组大鼠均有所减少(P<0.05)。(3)APO勃起功能实验：肝郁组大鼠的勃起潜伏期较对照组有所延长(P<0.05)，勃起次数较对照组有所减少(P<0.05)。结论:(1)采用复合情志造模法可成功建立中医肝气郁结证候大鼠模型，其生物学表征符合中医临床证候特点。(2)从肝气郁结证候大鼠模型中可成功筛选出阳痿病证大鼠模型，说明该模型具有可靠性。

肝气郁结；阳痿；动物模型；复合情志造模法

近年来，随着生活节奏加快，压力增大，男性勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)的发病率呈逐年上升趋势。勃起功能障碍现已成为当今社会困扰人类健康一大问题[1]。勃起功能障碍(ED)，是指男性在性生活时，阴茎不能勃起或勃起不坚或坚而不久，不能完成正常性生活，或阴茎根本无法插入阴道进行性交的一类男科疾病，中医称“阳痿”，又称“阳事不举”等。ED不但影响着患者的生活质量、家庭和睦与社会的和谐，更给男性患者造成较大的身心痛苦，当今社会是精神文明和物质文明高速发展的时期，ED越来越被社会所关注，近年来较多注重于ED的中医临床基础研究，对防治ED起到了很好的指导作用。ED发病的病因是多方面且复杂的[2]，中医认为ED的主要病因有情志刺激，房劳过度，劳伤久病，饮食不节，外邪侵袭等；基本病机为肝、肾、心、脾受损，经脉空虚，或经络阻滞，导致宗筋失养而发为ED[3]。本实验旨在通过复合情志造模法建立肝气郁结证大鼠模型，探讨肝气郁结证与ED的可能发病机制。从而筛选出更合适的肝气郁结致ED大鼠模型建立的方法。

1 材料

1.1 实验动物

20只清洁级雄性SD大鼠，10只性成熟雌性大鼠(鼠龄2.5个月)，平均体质量(200±20)g，由新疆医科大学动物实验中心购买。

1.2 主要试剂药物及实验仪器

阿扑吗啡(Apomorphine，APO，美国Sigma公司，批号：1001877691)，黄体酮(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：S151009)，雌二醇(宁波三生制药有限公司，批号：S151002),维生素C注射液(河南润弘制药股份有限公司，批号：1508151)。LT3002E电子天平:北京赛多科斯天平有限公司。观察箱：新疆医科大学解剖教研室提供。

2 方法

2.1 实验动物分组

20只雄性SD大鼠经交配实验及APO勃起功能实验证实，大鼠均具有正常性功能。采用随机数字表法分组，分为对照组、肝郁组，每组10只。实验第1～10天于常规环境饲养(温度22～27℃，湿度48%～53%，12/12 h人工照明)。第7天进行第一次性行为学交配实验及APO勃起功能实验。10天后进入造模阶段。

2.2 实验造模刺激方法

对照组于常规环境中饲养，每日予400 g普通饲料、1 000 mL水，不施予任何不良情志刺激。肝郁组大鼠常规方法饲养，每日予400 g普通饲料、1 000 mL水；采用复合情志造模法[4-6]，每日施予下列刺激中的一种：冰水浸泡(在塑料桶中盛4℃冰水，水深9 cm，将大鼠放入浸泡3 min)、禁水24 h、束缚(将大鼠固定于钢制束缚桶内4 h)、禁食24 h、夹尾(用25 cm长尾票夹在距尾端1 cm处30 min)、电击(将大鼠放入电击笼内，每笼5只，电击30 min,上调最大电压至35V)。每日一种刺激，连续30天，为达到不可预见性，采用分段不重复随机数字表法选取刺激顺序如表1。

表1 刺激顺序

2.3 造模期间观测指标

2.3.1 定性指标

(1)皮肤毛发：日光灯下观察毛发的荣枯。(2)日常活动：观察600 s并保证周围无杂音，主要观察各大鼠的活动情况及相互反应灵敏度。(3)睡眠状态：灯光调暗并保持安静，观察1 800 s，观察大鼠休息情况。(4)刺激反应：用夹尾实验判断大鼠对刺激的反应。(5)饮水状态：给予水时，观察其饮水情况，主要是观察大鼠有无互相争水现象。(6)尿：主要观察大鼠当时排出小便的量与色的情况。(7)大便：主要观察大鼠当时排出大便的量与形态。

2.3.2 定量指标

(1)体质量：每周三做完性行为学实验后，对大鼠进行称质量。(2)性行为学指标。(3)APO勃起功能实验。

2.4 性行为学交配实验及APO勃起功能实验的操作方法

2.4.1 性行为学交配实验

实验安排在北京时间20:00开始，保持室内安静，调暗灯光，以刚好能看清为宜。将实验雄鼠放置于观察箱中5～10 min适应环境后，将雌鼠(已进行发情期制备)轻轻放入笼中。每只观察箱中放置1只雄鼠，2只雌鼠。观察1 800 s内雄性大鼠的爬背潜伏期、爬背次数、插入潜伏期、插入次数、射精潜伏期、射精次数。若雄性大鼠在1 800 s内未进行爬背，则该大鼠爬背潜伏期记为1 800 s,爬背次数记为0。插入与射精行为同理[7]。

2.4.2 APO勃起功能实验

参照Heaton[8]等的方法，实验安排在北京时间20:00开始，保持室内安静，调暗灯光，以刚好能看清为宜。将实验雄鼠放置于观察箱中5～10 min适应环境，每只观察箱中放置3只雄鼠。在大鼠皮下注射盐酸阿扑吗啡90 μg/kg(0.5 mg/kg维生素C于中溶解阿扑吗啡后，与5 mL/kg生理盐水混匀)，注射后立即观察，采用倒计时法记录大鼠在1 800 s内的勃起潜伏期、勃起次数。若1 800 s内未见勃起，则该大鼠勃起潜伏期记为1 800 s，勃起次数记为0。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 生物学表征变化

造模期间肝郁组大鼠逐渐出现毛发杂乱且粗糙暗淡无光泽，体型瘦小，倦怠嗜卧，贴边喜扎堆，饮食减少，争水现象明显减少甚至消失，对刺激的反应逐渐减弱，易捕捉，尿量减少，色偏黄，大便溏薄，舌质黯，苔薄腻，有瘀点。对照组大鼠毛发顺，有光泽，日常活动及睡眠状态正常，偶有相互追打现象，对刺激(夹尾实验)的反应敏感，有正常的争水现象，尿为浅黄色，尿量正常，大便成形，舌质淡红，苔薄白。

3.2 体质量

造模第1周，肝郁组体质量与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。造模第2周，肝郁组大鼠体质量较对照组相比减少(P<0.05)。造模第3～4周，肝郁组大鼠体质量较对照组相比显著减少(P<0.01)。见表2。

3.3 性行为学交配实验结果

造模第1～2周，肝郁组大鼠与对照组相比，爬背潜伏期、爬背次数、插入潜伏期、插入次数、射精潜伏期、射精次数差异均无统计学意义(P>0.05)。造模第3周，肝郁组大鼠爬背次数、插入次数、射精次数较对照组相比均减少(P<0.05)，而爬背潜伏期、插入潜伏期、射精潜伏期较对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。造模第4周，肝郁组大鼠爬背次数、插入次数、射精次数较对照组相比均减少(P<0.05)，爬背潜伏期、插入潜伏期、射精潜伏期较对照组相比均增加(P<0.05)。见表3～表8。

3.4 APO勃起功能实验结果

造模第1～2周，肝郁组大鼠与对照组相比，勃起潜伏期和勃起次数差异均无统计学意义(P>0.05)。造模第3～4周，肝郁组大鼠较对照组相比勃起潜伏期增加(P<0.05)，勃起次数减少(P<0.05)。见表9～表10。

表2 各组体质量比较

注：与对照组比较,*P<0.01，**P<0.01

表3 各组爬背潜伏期比较

注：与对照组比较,*P<0.05

表4 各组爬背次数比较

注：与对照组比较,*P<0.05

表5 各组插入潜伏期比较

注：与对照组比较,*P<0.05

表6 各组插入次数比较

注：与对照组比较,*P<0.05

表7 各组射精潜伏期比较

注：与对照组比较,*P<0.05

表8 各组射精次数比较

注：与对照组比较,*P<0.05

表9 各组勃起潜伏期比较

注：与对照组比较,*P<0.05

表10 各组勃起次数比较

注：与对照组比较,*P<0.05

4 讨论

临床流行病学资料显示，在五脏病证中，中医肝脏病证占总体病证40%[9]，而肝郁证是肝脏病证的基本病理变化，是肝病证候的核心，是最为常见的中医脏腑证候之一。因此建立和复制中医“肝郁证”模型对研究中医临床病证的辨证论治有着重要的意义。本实验旨在建立肝气郁结证的大鼠模型，进而探讨肝气郁结证与发生ED的可能机制。

4.1 肝气郁结证致ED大鼠模型的建立原理

阴器的正常功能既依赖肾精肾气的充盈，也依靠肝脏疏泄功能的正常。肝主疏泄，体阴用阳，喜条达而恶抑郁。当下社会、家庭生活压力增大，使肝气郁结证型发病率日益增高，成为最常见的中医证型之一[10]。因此我们实验从肝郁论治，认为肝郁可以导致ED。历代古籍中关于肝郁致ED也可找到相关理论依据。如《素问·厥论》指出：“前阴者，宗筋之所聚”。《灵枢·经脉》载有：“肝，足厥阴之脉……循阴股，入毛中，过阴器……其别者，经胫上睾，结于茎”。其他如《增补病机沙篆》也指出阴器由宗筋所系，统属于肝；也即阴茎勃起必须以肝气和肝经功能正常为保证，若肝脏及肝经为病，势必累及宗筋发为ED。总之，肝脏情志调畅是保持阴茎正常勃起的基本条件之一。情志和调则气机升降自如、气血调畅，若有所动情，阴茎则能勃发而起；若情志活动异常，气机失调、气血运行不循常道，无法完成勃起活动，则发ED。郁怒、思虑、惊恐、悲忧等情志因素是肝郁ED的主要发病原因。

据此查阅近20年文献，搜索了阳痿、肝气郁结证、大鼠模型、ED等关键词，结果显示近年来关于肝郁证动物模型的建立方法主要有下面几种：①药物造模法：艾叶注射法和肾上腺皮下注射法；②情志刺激造模法：颈部带枷单笼饲养法、夹尾激怒打斗法和捆绑法；③药物+情志刺激造模法[11]。而在组合了肝气郁结证与ED两个关键词后搜索文献，我们发现虽然有关于肝郁证ED大鼠模型的研究，但研究者甚少。仅有研究者在研究肝郁证ED大鼠模型时，采用束缚盒慢性应激法建立肝郁证大鼠模型后，探讨肝郁证与ED的发病机制[12]；至今尚未见用复合情志造模法建立肝气郁结证致ED大鼠的模型，因此本实验以“证候模型”为造模理念，以复合情志造模法为干预方法建立肝气郁结证致ED的大鼠模型。实验随机组合了慢性的不可预见的复合不同情志刺激方法，使动物无法预知未来刺激，避免适应现象的发生，也可更好地模拟临床情志异常引发肝郁证的过程。以此方法建立的中医肝郁证大鼠模型可以造成大鼠不适而又无法缓解，进而大鼠有气不能发泄而抑制体内的愤恨，忧思郁怒，情志不遂，致肝失调达，疏泄不利，气机不畅，脉络不张，血液不充，宗筋弛纵，引发ED。

4.2 生物学表征

肝郁证的基本病机是肝失疏泄，临床主要表现为：精神抑郁，情绪不宁，胸部满闷，胁肋胀痛，痛无定处，脘闷嗳气，不思饮食，大便不调，苔薄腻，脉弦[13]。本实验中肝郁组大鼠随着造模周期的延长，逐步开始出现肝气郁结的证候特点，即：饮食量、饮水量及尿量均减少，大便溏薄，体质量增长缓慢甚至下降。在行为上，表现为倦怠嗜卧，贴边喜扎堆，由最初喜欢争水到最后争水现象减少甚至消失。舌象由最初淡红舌、薄白苔变为舌质黯淡、苔薄白、有瘀点。以上生物学表征的变化与文献[13-14]中描述的大鼠肝气郁结证候基本一致,符合中医临床肝气郁结证候特点。

4.3 体质量变化

随着造模时间的延长，肝郁组大鼠的体质量增长逐渐缓慢甚至下降，与性功能下降呈正相关关系。体质量下降可作为肝气郁结证的一项判定标准[13]。肝郁组体质量下降反映了本实验采用的慢性的不可预知的复合情志造模法建立的肝气郁结证大鼠模型是可靠的。

4.4 性行为学实验及勃起功能实验

随着造模周期的延长，同时可见阴茎勃起功能与性行为学能力逐渐减退。具体表现为：在APO勃起功能实验中，肝郁组大鼠的勃起潜伏期较对照组逐渐延长，勃起次数较对照组逐渐减少。在性行为学交配实验中，肝郁组大鼠的爬背潜伏期、插入潜伏期、射精潜伏期较对照组均逐渐延长，而爬背次数、插入次数、射精次数较对照组均逐渐减少甚至消失。证明随着造模周期的延长，肝郁组大鼠的阴茎勃起功能与性行为学能力逐渐减退。直至造模第4周，APO勃起功能实验中不能正常勃起且性行为学交配实验中不能交配的大鼠占肝郁组全部大鼠的50%。说明通过慢性的不可预知的复合情志造模法可以筛选出肝气郁结证致ED大鼠模型。

本实验表明，从模拟病因、证候表现、慢性应激过程等方面建立的肝气郁结证致ED大鼠模型符合中医肝气郁结证的临床特点，筛选出的ED大鼠模型也比较稳定。我们认为采用慢性的不可预知的复合情志造模法建立的肝气郁结证致ED大鼠模型是可靠的。

[1] Segraves RT.Considerations for diagnostic criteria for erectile dysfunction in DSM V[J].The journal of sexual medicine,2010,7(2):654-660.

[2] Hamdna FB,Al-Matubsi HY.Assessment of erectile dysfunction in diabetic patients[J].International journal of andrology,2009,32(2):176-185.

[3] 蒋平，戴宁，王祖龙.勃起功能障碍证治心得[J].中医药信息,2014,31(4):151-152.

[4] 金光亮,南睿,郭霞珍.慢性应激肝郁证大鼠模型的建立[J].北京中医药大学学报,2003,26(2):18-21.

[5] 金光亮,王胜兰.关于建立肝郁证动物模型的思考[J].山东中医药大学学报,2004,28(6):408-409.

[6] 于琦,金光亮.四逆散、归脾汤与温胆汤对慢性应激肝郁模型大鼠行为学的影响[J].广州中医药大学学报,2009,26(2):148-151.

[7] Lumley LA,Hull EM.Effects of a D1 antagonist and of sexual experience on copulation-induced Fos-like immunoreactivity in the medial preoptic mucleus[J].Brain research,1999,829(1):55-68.

[8] Heaton JP,Varrin SJ,Morales A.The characterization of bio-assay of erectile function in a rat model[J].The Journal of urology ,1991,145(5):1099-1102.

[9] 杨文明,陈彪,鲍远程,等.肝郁证实验研究概览[J].中国中医药信息杂志,2004,11(12):1125-1127.

[10] 滕晶,王玉来,刘子旺.肝气郁结证的研究总结与未来发展探讨[J].中医药学刊,2006,24(12):2220-2221.

[11] 徐建阳,覃菁,陈慧侬,等.中医肝郁证的动物模型研究[J].广州中医药大学学报,2004,2l(1):73-76.

[12] 张立侠,王慧.肝郁证勃起功能障碍大鼠模型建立的实验研究[J].中华男科学杂志,2006,20(11):29-31.

[13] 周仲瑛.中医内科学[M].北京:中国中医药出版社,2003:393.

[14] 乔明琦,张惠云,陈雨振,等.肝郁证动物模型研究的理论思考[J].中国医药学报,1997,12(5):42-44.

2016-10-08

2016-12-30

国家自然科学基金项目(81260526)；新疆自然科学基金项目(2015211C023)

王丽(1994-)，女，专业:中西医临床医学。

*通讯作者：张星平(1961-)，男，教授，主任医师，博士研究生导师，研究方向：中医药防治肾病、不孕不育、男科疾病等。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0009-05