丹蒌护冠方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制研究

2017-06-27李彩红王永刚钟伟蔡倩玮齐婧尚俊平

中医药学报 2017年3期

关键词：中医药大学低剂量研究进展

李彩红,王永刚, 钟伟,蔡倩玮,齐婧,尚俊平

(1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西咸阳 712000)

丹蒌护冠方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制研究

李彩红1,王永刚2*, 钟伟2,蔡倩玮1,齐婧2,尚俊平2

(1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西咸阳 712000)

目的：研究丹蒌护冠方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的SOD、MDA、ET、NO含量和心肌细胞Bax、bcl-2表达的影响。方法：SD大鼠随机分为假手术组、模型组、丹蒌护冠方低剂量组(2.5 g/mL)、中剂量组(5 g/mL)和高剂量组(7.5 g/mL)，每组12只。丹蒌护冠方低剂量、中剂量和高剂量组分别给予相关浓度的丹蒌护冠方浓缩液，假手术组及模型组予等量生理盐水。各组大鼠均灌胃2周后，麻醉开胸，6～0无创缝线结扎大鼠左冠状动脉前降支30 min后，剪开缝线，再灌注120 min，建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，假手术组只穿线不结扎。取出大鼠心脏，Elisa法检测心肌组织匀浆中SOD、MDA、ET、NO含量，Western blot法检测心肌组织Bax、bcl-2表达。结果：与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织SOD活性和NO含量降低，MDA和ET含量升高，Bax表达增高，bcl-2表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，丹蒌护冠方低剂量、中剂量和高剂量组大鼠心肌组织SOD活性和NO含量升高，MDA和ET含量降低，Bax表达降低，bcl-2表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与丹蒌护冠方中剂量比较，丹蒌护冠方低剂量组心肌组织NO含量降低，MDA含量升高，丹蒌护冠方高剂量组心肌组织SOD活性和NO含量升高，MDA和ET含量降低，Bax表达降低，bcl-2表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：丹蒌护冠方具有干预大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用，其机制可能与丹蒌护冠方增加SOD活性和NO含量，降低MOD、ET含量，抑制氧化应激反应，改善血管内皮功能，调控凋亡基因的表达有关。

丹蒌护冠方；心肌缺血再灌注损伤；保护机制

心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是在指急性心肌缺血基础上恢复血流再灌注后，不能使心脏功能恢复，反而加重心脏的功能障碍和结构损伤的现象[1]。其发生机制尚未完全阐明，研究表明氧自由基、钙超载、心肌能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、炎性反应和细胞自噬、凋亡、坏死等因素均可能参与MIRI 的病理过程[2]。随着冠状动脉介入术、冠状动脉搭桥术在临床的应用，心肌缺血再灌注损伤在临床极为常见，受到国内外学者的广泛关注。中药复方具有多成分、多靶点、多途径的特点，在防治心肌缺血再灌损伤方面具有一定的优势，可从多个机制保护心肌[3]。本实验拟采用药物预处理的方法，探索丹蒌护冠方对心肌缺血再灌注损伤的保护机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，体质量(200±20)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2012-003。

1.2 实验药物

丹蒌护冠方(由丹参、瓜蒌、半夏、薤白、肉桂、三七粉等组成，陕西中医药大学第二附属医院制剂室制备)，丹蒌护冠方低剂量2.5 g/mL(相当于生药材6 g)，丹蒌护冠方中剂量5 g/mL(相当于生药材12 g)，丹蒌护冠方高剂量7.5 g/mL(相当于生药材18 g)。

1.3 仪器与试剂

Ascent全自动酶标仪，美国Thermo公司；UV762双光束紫外可见分光光度计，上海精密仪器厂；ELISA试剂盒：一氧化氮(NO)测试盒、内皮素(ET)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒，以上试剂盒由北京诚林生物科技有限公司提供；HX-100E小动物呼吸机，成都泰盟软件有限公司；GS-15R冷冻离心机，美国Bekman公司；DYY-6C电泳仪；羊抗兔二抗，武汉博士德生物科技有限公司。

1.4 分组与给药

60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、丹蒌护冠方低剂量组(2.5 g/mL)、中剂量组(5g/mL)和高剂量组(7.5 g/mL)，每组12只。丹蒌护冠方低剂量、中剂量和高剂量组分别给予相关浓度的丹蒌护冠方浓缩液，假手术组及模型组予等体积生理盐水，灌胃10 mL/kg，各组均提前给药2周。除假手术组外，2周后各组均复制心肌缺血再灌注损伤模型。造模成功后，每组(含假手术组) 随机选取8只大鼠进行指标检测。

1.5 造模方法

大鼠称体质量，3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，监测Ⅱ导联心电图，气管插管连接小动物呼吸机，经左前胸3～4肋间开胸，充分暴露心脏，用6～0无创缝线结扎左冠状动脉主干支(在动脉圆锥与左心耳之间距主动脉根部约1 mm处)，心电示波器显示Ⅱ导联J点或ST段抬高>0.2 mV，局部心肌颜色变暗30 min后，剪开缝线，再灌注120 min，建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，假手术组只穿线不结扎。

1.6 观察指标

1.6.1 Elisa法检测大鼠心肌组织SOD、MDA、ET、NO含量

取出大鼠心肌组织，解冻后用冰盐水漂洗，取0.3 g心肌组织，用眼科剪刀剪碎，置于预冷的玻璃匀浆器中，将捣杆垂直充分研磨6～8 min，使组织匀浆化，低温4 000 r/min离心15 min后取上清液，采用Elisa法检测心肌组织中SOD、MDA、ET、NO的含量。

1.6.2 Western blot检测大鼠心肌组织Bax、bcl-2表达

将心肌组织置于匀浆器中剪碎并匀浆，加400 μL裂解液裂(含PMSF)置于冰上，裂解30 min后将裂解液移至15 mL离心管中，4℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液后采用BCA法进行蛋白定量，取等量蛋白进行SDS-PAGE，将蛋白质电转移到PVDF膜上，脱脂奶粉(TBST缓冲液配制)室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃摇床孵育过夜，TBST缓冲液洗脱×3次后加入二抗(1∶100)，室温孵育2 h后TBST缓冲液洗脱3次，化学发光法(ECL)法显影、定影并胶片曝光。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织SOD、MDA含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织SOD活性降低，MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，丹蒌护冠方低剂量、中剂量和高剂量组大鼠心肌组织SOD活性升高，MDA含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与丹蒌护冠方中剂量比较，丹蒌护冠方低剂量组心肌组织MDA含量升高，丹蒌护冠方高剂量组心肌组织SOD活性升高，MDA含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 丹蒌护冠方对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织SOD、MDA含量的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与丹蒌护冠方中剂量比较，&P<0.05

2.2 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织NO、ET含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织NO含量降低， ET含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，丹蒌护冠方低剂量、中剂量和高剂量组大鼠心肌组织NO含量升高， ET含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与丹蒌护冠方中剂量比较，丹蒌护冠方低剂量组心肌组织NO含量降低，丹蒌护冠方高剂量组心肌组织NO含量升高，ET含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 丹蒌护冠方对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织NO、ET含量的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与丹蒌护冠方中剂量比较，&P<0.05

2.3 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织Bax、bcl-2基因表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Bax表达增高，bcl-2基因表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，丹蒌护冠方低剂量、中剂量和高剂量组大鼠心肌组织Bax表达降低，bcl-2基因表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与丹蒌护冠方中剂量比较，丹蒌护冠方高低剂量组心肌组织Bax和bcl-2基因表达无显著差异(P>0.05)，丹蒌护冠方高剂量组心肌组织Bax表达降低，bcl-2基因表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 丹蒌护冠方对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织Bax、bcl-2基因表达的影响注：1.假手术组；2.模型组；3.丹蒌护冠方低剂量组；4.丹蒌护冠方中剂量组；5.丹蒌护冠方高剂量组

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤属于中医“胸痹”“真心痛”的范畴[4-5]，因年老体虚，心阳不振，心阴内耗；或素体阳虚，胸阳不展，血行不畅；或情志失调，气滞痰浊，而痹阻心脉；或饮食不当，损伤脾胃，以致清阳不升、气机不畅、心脉痹阻，引发本病，本病病机为本虚标实，本虚主要为气血阴阳的虚损，标实主要为气滞、血瘀、痰毒[6-7]。故中医治疗以扶正补虚为主，辅以活血化痰、解毒散结为基本原则[8-9]。

丹蒌护冠方由丹参、瓜蒌、半夏、薤白、肉桂和三七粉等组成，具有化痰散结、活血通络的功效。现代药理学研究表明：丹参酮ⅡA可升高心肌脂肪酸结合蛋白水平，升高心肌线粒体Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性，降低心肌组织缺血修饰白蛋白含量，抑制调亡加速基因bax 的表达,降低大鼠心肌梗死面积，减轻心肌细胞变性坏死程度，降低缺血再灌注对心肌线粒体的损伤从而保护心肌[10-11]。瓜蒌能增加离体豚鼠心脏冠脉血流量，改善缺血心肌能量和氧的供需平衡，可降低凋亡细胞数、MDA含量和CK活性，升高SOD活性和NO含量，抑制血小板氧合酶活性，减少血栓素A2而发挥抗血小板聚集作用[12-13]。瓜蒌薤白半夏汤可上调JAK2、STAT3、Bcl-2的表达，下调Bax表达，抑制心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的发生，上调VEGF 蛋白和基因的表达、升高MVD，促进大鼠MIRI后心肌组织的血管新生，形成冠脉侧支，减少心肌梗死面积，对缺血再灌注心肌起保护作用[14-16]。

研究表明，心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中起主导作用，有多种凋亡基因共同调控心肌细胞凋亡过程，其中Bcl-2在抑制细胞凋亡中起着关键作用，而Bax在细胞凋亡中起着促进作用[17]。本实验结果证实，丹蒌护冠方可增加SOD活性和NO含量，降低MOD、ET含量，促进Bcl-2表达，通过抑制氧化应激反应，改善血管内皮功能能，调控凋亡基因的表达等途径干预心肌缺血再灌注损伤从而保护心肌。

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