昆明市鸡源大肠埃希菌耐药基因的流行特征研究

杨 娟，吴海滨，谭 珊，宋欣媛，王 肖，吴培福

(西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224)



昆明市鸡源大肠埃希菌耐药基因的流行特征研究

杨 娟△，吴海滨△，谭 珊，宋欣媛，王 肖，吴培福*

(西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224)

为了解昆明市区农贸市场鸡源大肠埃希菌耐药基因的携带情况，采用PCR技术对140株鸡肝中大肠埃希菌的22个耐药基因进行了检测。研究表明，140株大肠埃希菌中TEM和Gyra(QRDR)基因检出率最高为100%；aph(3)-Ⅱa基因的检出率最低为22.86%，且13个耐药基因检出率在50%以上。呈贡区、官渡区、盘龙区、五华区、西山区检出率最低的耐药基因分别为aph(3)-Ⅱa、OXA、tetB和OXA、SHV、aac(3)-Ⅱa基因。研究结果可为大肠埃希菌病的临床用药提供理论指导，为公共卫生安全提供参考依据。

鸡源大肠埃希菌；耐药基因；流行特征

禽大肠埃希菌病是由致病性大肠埃希菌(Escherichiacoli)引起的细菌性传染病[1]。现已成为养禽业中最常见的病原菌之一。本病在防治过程中，随着抗生素的使用，大肠埃希菌对抗菌药物的耐药性不断的增加[2]。动物大肠埃希菌携带的耐药基因可能会随着食物链传播给人类[3]。为此，本研究检测由昆明市区农贸市场鸡肝分离出的大肠埃希菌耐药基因的携带情况，可为大肠埃希菌病的临床用药提供理论依据，为公共卫生安全提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

140株大肠埃希菌由实验室分离鉴定保存；伊红美蓝培养基(EMB)、蛋白胨、酵母粉、氯化钠均购自昆明硕阳科技有限公司。

1.2 大肠埃希菌DNA提取

通过煮沸法[4]提取大肠埃希菌基因组DNA。将复壮好的大肠埃希菌以1∶100接种量接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养8 h。取6 mL培养物10 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清液，加入200 μL ddH2O使菌体悬浮，100℃水浴10 min后立即冰浴10 min，然后10 000 r/min 4℃离心5 min，上清即为DNA模板，并于-20℃保存。

1.3 耐药基因的扩增

本研究对22个耐药基因携带情况进行了检测。包括磺胺类耐药基因(sul1、sul2、sul3)；四环素类耐药基因(tetA、tetB)，氨基糖苷类耐药基因(aacC2、aacC4、aadAl、aadA2、aac(3)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱa、aph(3)-Ⅱa)，氯霉素类耐药基因(Catl、CmlA、Flor)，β-内酰胺类耐药基因包括(CTX-M、SHV、OXA、TEM)，喹诺酮类基因包括Gyra(QRDR)、QnrS，其他基因Aac(6′)-Ib-cr。扩增引物及参数参考文献5。引物由铂尚生物技术有限公司合成。

2 结果

2.1 大肠埃希菌耐药基因PCR检测情况

采用PCR技术，对140株大肠埃希菌的22个耐药基因进行了检测，结果见表1。TEM和Gyra(QRDR)基因检出率最高为100%；aph(3)-Ⅱa基因的检出率最低为22.86%。13个耐药基因检出率在50%以上。磺胺类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类、β-内酰胺类、喹诺酮类检出率最高的基因分别为sul2、tetA、aadA2、Flor、TEM、Gyra(QRDR)基因。

昆明市不同区的耐药基因的检出率不同。呈贡区、官渡区、盘龙区、五华区、西山区检出率最低的耐药基因分别为aph(3)-Ⅱa、OXA、tetB和OXA、SHV、aac(3)-Ⅱa基因。sul2基因在西山区的检出率最低，其他区的检出率均为100%。

2.2 大肠埃希菌同时携带耐药基因的数量

分离株同时携带了6个以上耐药基因，同时携带10个以上耐药基因的大肠埃希菌占分离株的90.71%；同时携带15个以上耐药基因的大肠埃希菌占分离株的38.57%；同时携带14个耐药基因的大肠埃希菌数最多(26株)。

表1 昆明市大肠埃希菌耐药基因阳性率

注：A.呈贡区;B.官渡区;C.盘龙区;D.五华区;E.西山区。

Note:A.Chenggong region;B.Guandu region;C.Panlong region;D.Wuhua region;E.Xishan region.

3 讨论

由于禽致病性大肠埃希菌的血清型比较多，抗生素仍是防治大肠埃希菌病最重要的方法之一，但由于抗生素的使用不当，使得许多细菌对药物都产生了耐药性，并且耐药谱不断增宽[6]。在不久的将来，抗生素可能很难治疗禽大肠埃希菌病[7]。禽致病性大肠埃希菌耐药性与其耐药基因的携带率有明显的相关性，为此，耐药基因的检测对生产实践有重要的指导意义。

在本研究中，22个耐药基因全部检出，除β-内酰胺类的TEM基因和喹诺酮类的Gyra(QRDR)基因的检出率为100%外，其余都有不同比例的检出。牛建宁[8]对陕西鸡大肠埃希菌四环素的tetA和tetB耐药基因检出率分别为81.4%、21.7%，比本研究结果高；除aac(3)-Ⅱa和tetB基因外其余磺胺类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类、β-内酰胺类耐药基因的检出率均比张忠[5]的检出率高；喹诺酮类和其他耐药基因均比张飞燕[9]对河北省鸡病样中检出率高。

昆明市不同区对22个耐药基因的检出率存在着差异。这与农贸市场进货渠道不同有很大的关系，昆明市周边养鸡场使用抗生素的偏向性不同，从而导致不同的养殖场对抗生素的耐药性不同。这样不同区农贸市场鸡肝中大肠埃希菌的耐药基因的检出率存在着差异。

综上所述，本研究中的大肠埃希菌分离于昆明市农贸市场鸡肝中，大多数耐药基因的检出率均比之前的研究结果偏高。说明昆明市农贸市场鸡肝中大肠埃希菌耐药基因携带率高，同时也反映出昆明市周边鸡场不恰当的使用抗生素。而农贸市场的食品有关公共卫生安全，鸡肝中大肠埃希菌的耐药基因很可能传播给人类，应该减少抗生素在临床上的使用，或者找抗生素的替代药。本研究可为治疗禽致病性大肠埃希菌病的临床用药提供理论依据。

[1] 严杜建.禽源性大肠埃希菌研究进展[J].畜牧与饲料科学,2016,04:87-89,107.

[2] 李 栋.禽源大肠埃希菌质粒介导氟喹诺酮类耐药基因的检测及中药消除耐药性研究[D].江苏扬州:扬州大学,2015.

[3] Yan X M,Wang B,Tao X X,et al.Characterization ofStaphy-lococcusaureusstrains associated with food poisoning in Shenzhen,China[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(18):6637-6642.

[4] 许一平.多重PCR检测沙门菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的研究[D].湖北武汉:华中农业大学,2006.

[5] 张 忠.宁夏地区大肠埃希菌临床分离株的耐药性研究[D].宁夏银川:宁夏大学,2013.

[6] 曹春光.苏鲁部分地区禽致病性大肠埃希菌的分离及2个O78分离株致病性的研究[D].江苏扬州:扬州大学,2015.

[7] Mohamed M A,Shehata M A,Rafeek E.Virulence genes content and antimicrobial resistance inEscherichiacolifrom broiler chickens.[J].Vet Med Int,2013,2014:195189.

[8] 牛建宁,崔恩慧,唐 攀,等.鸡源致病性大肠埃希菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因检测[J].西北农业学报,2014,11:35-39.

[9] 张飞燕.鸡源性大肠埃希菌耐药性检测及相关耐药基因的研究[D].河北保定:河北农业大学,2013.

Study on Epidemiologic Characteristics of Drug Resistance Genes of AvianEscherichiacoliin Kunming

YANG Juan,WU Hai-bin,TAN Shan,SONG Xin-yuan,WANG Xiao,WU Pei-fu
(CollegeofLifeScience,SouthwestForestryUniversity,Kunming,Yunnan,650224,China)

To study the carrying situation of drug resistance genes of avianEscherichiacoliin the markets of Kunming city,a total of 22 resistance genes were checked in 140 avianEscherichiacoliisolates of chicken livers by PCR.The results showed that the carrying rates ofTEMandGyra(QRDR) genes were the highest in 140 strains ofEscherichiacoli,which was 100%.Theaph(3)-Ⅱagene carrying rate was the lowest,which was 22.86%,and the detection rate of 13 resistant genes was more than 50%.In Chenggong district,Guandu district,Panlong district,Wuhua district,Xishan district,the lowest detection rates of resistant gene wereaph(3)-Ⅱa,OXA,tetBandOXA,SHV,aac(3)-Ⅱa.The results provided a theoretical support for the clinical rational drug uses,and provided the reference for public health security.

avianEscherichiacoli; drug resistance gene; epidemiological characteristics

2016-10-19

云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目(50097505)；云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队(51400605)

杨 娟(1992-)，女，云南人，硕士研究生，主要从事动物疫源疫病研究。△同等贡献作者。*通讯作者

S852.612

A

1007-5038(2017)06-0017-03