典型胞外呼吸细菌的胞内电子转移机制研究进展

赵昕宇, 何小松,檀文炳,高如泰,席北斗1,, 李 丹, 张 慧

1 北京师范大学水科学研究院,北京 100875 2 中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012 3 中国环境科学研究院地下水与环境系统创新基地,北京 100012 4 广东省浩蓝环保水污染治理院士工作站,广州 510631



典型胞外呼吸细菌的胞内电子转移机制研究进展

赵昕宇1, 2,3, 何小松2, 3, 4,*,檀文炳2,3,高如泰2,3,席北斗1,2,3, 李 丹2,3, 张 慧2, 3

1 北京师范大学水科学研究院,北京 100875 2 中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012 3 中国环境科学研究院地下水与环境系统创新基地,北京 100012 4 广东省浩蓝环保水污染治理院士工作站,广州 510631

胞外呼吸在污染物的降解转化和微生物产电过程中具有重要作用。微生物进行胞外呼吸时,其电子受体多以固态形式存在于胞外,氧化产生的电子必须通过电子传递链从胞内经细胞周质转移到外膜。S.oneidensisMR- 1与G.Sulfurreducens作为微生物燃料电池中最常用的模式菌株,是现阶段研究最深入和系统的胞外呼吸细菌,其胞内电子传递过程目前研究最为清楚。这两种胞外呼吸细菌的电子传递需多种细胞色素c的参与,S.oneidensisMR- 1位于内膜及周质上的细胞色素c-CymA和MtrA可将电子由内膜上的醌池通过周质到外膜蛋白MtrC和OmcA,MtrC和OmcA接收电子后可直接还原胞外受体,Type Ⅱ secretion system对外膜蛋白中的MtrC和OmcA起到了转运及定位的作用。而在G.sulfurreducens中,电子由MacA传递到PpcA,最终由外膜蛋白OmcB、 OmcE、 OmcS及OmcZ接受电子,并在Type Ⅳ pili的共同作用下将电子传递到胞外电子受体。本文最后指出目前对Shewanella与Geobacter胞内电子转移研究尚不清楚的地方提出展望。

胞外呼吸；胞内电子转移；Shewanella；Geobacter

电子转移是新陈代谢的基础,在细胞水平的研究领域中,现如今所了解的电子转移机制有光合作用和呼吸作用。在这两种电子传递链中,水溶性电子受体如氧气、硝酸盐、延胡索酸等,可以通过细胞质膜,穿过外膜蛋白或肽聚糖层,接受电子从而完成电子传递过程[1]。胞外呼吸是近年来新发现的微生物能量代谢方式,它是指在厌氧条件下,微生物在胞内彻底氧化有机物释放电子,产生的电子经胞内呼吸链传递到胞外电子受体使其还原并产生能量维持微生物自身的生长过程[2]。这与传统胞内厌氧呼吸不同,胞外电子受体为固体或大分子有机物,无法进入胞内,因此,电子要在多种细胞色素c及功能蛋白作用下,从内膜通过周质空间穿过外膜,传至胞外受体使其还原,并产生能量维持自身的生长[2- 3]。

胞外呼吸菌在环境中广泛存在,人们已经在土壤、泥炭、污泥、湖泊沉积物、河流沉积物、海洋沉积物以及水体等环境介质中分离富集出了许多具有胞外呼吸功能的微生物,而且在地球化学循环(碳、氮、硫)、污染物降解以及微生物燃烧料电池方面发挥重要作用[4]。根据胞外电子受体的不同,微生物胞外呼吸菌主要分为腐殖质还原菌、异化金属还原菌和产电微生物[5- 7]。除了常规微生物,许多极端环境微生物也具有胞外电子传递能力,例如嗜热菌、嗜酸菌、嗜碱菌等[8]。根据对氧气的需求,胞外呼吸菌可分为兼性厌氧菌和严格厌氧菌。其中大部分集中在以下3个门：Proteobacteria(变形杆菌门)、Acidobacteria(放线菌门)与Firmicutes(厚壁菌门)[4]。已发现的胞外呼吸菌种大多数为革兰氏阴性菌,只有少数为阳性菌。目前报道的胞外呼吸菌的数量仅占自然界的极小部分,很多菌的功能机制还不完全清楚。随着研究的不断深入以及微生物分离方法和分子生物学技术的不断完善,胞外呼吸菌的资源将会继续不断被发现和丰富。

ShewanellaoneidensisMR- 1与Geobactersulfurreducens作为微生物燃料电池中最常用的模式菌株,是迄今为止研究最深入和系统的胞外呼吸细菌[11]。到目前为止,两种微生物基因组的研究发现在S.oneidensisMR- 1和G.sulfurreducensPCA中分别有42个和111个与细胞膜相关的细胞色素c基因[9-10],但已经确定功能的细胞色素c仅有几种,且大量的基因功能还不完全清楚。尽管这两种功能菌参与电子传递的细胞色素c各不相同,但都可催化化学反应及其相应的电化学性能,使得电子由内膜向胞外的最终电子受体传递,再通过不同的接触机制对胞外电子受体进行还原。本文详细阐述了S.oneidensisMR- 1与G.sulfurreducens的胞内电子转移机制和参与胞内电子转移细胞色素c的特点及功能,以期对胞内电子转移机制有更全面、深入的理解和认识。

1 电子转移过程中的细胞色素c

细胞色素c普遍存在于几乎所有的生物体中,它也是参与胞外电子传递过程的重要蛋白,存在于胞外呼吸菌的内膜、周质及外膜蛋白中,能够介导电子从内膜向外膜的传递[11]。不同细胞色素c的氨基酸序列各不相同,但它们都至少含有一种或几种亚铁血红素。两个邻近的血红素通过半胱氨酸(Cys)的硫醚键与蛋白部分相结合,从而促进其与氧气结合的能力,其催化作用、电子转移及积累能力取决于与其结合的功能蛋白[12-13]。多个亚铁血红素基团可还可形成一个连续的“电子导线”,并与蛋白复合形成多亚铁血红素的细胞色素c,而细胞色素c中至少有一个血红素基团与另一个细胞色素c的血红素基团接近,从而完成多个细胞色素c间的长距离的电子传递[13]。

2 S.oneidensis MR- 1参与电子传递的细胞色素c

S.oneidensisMR- 1通过质子泵产生电子,电子经脱氢酶(如甲酸脱氢酶或氢化酶)将醌还原为对苯二酚,对苯二酚在胞内再次被氧化,产生的电子进入周质内可以对可溶性电子受体直接还原(如延胡索酸、硝酸盐、三甲胺氧化氮、二甲亚砜、亚硫酸盐及硫代硫酸盐)[14]。而不能进入胞内的大分子电子受体(如Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅴ)、Cr(Ⅵ)及腐殖酸等),需要特殊的电子传递途径将电子传递到胞外。

胞内电子传递过程中的首先是脱氢酶从电子供体脱下电子,传递给醌类中间体。Saffarini等[15]用转座子TN5插入突变得到甲基萘醌合成缺陷型的菌株,证明了甲基萘醌是胞内电子传递中的一个必要构件。电子从醌类中间体传递给镶嵌到内膜蛋白的CymA,再由CymA传递至周质细胞色素并向外膜蛋白传递(图1),目前发现镶嵌在周质和外膜上的MtrA是这一过程的主要电子受体,MtrA缺失将导致细胞与胞外电子受体之间的电子传递下降90%以上[16- 18]。而后电子从MtrA向胞外传递,即外膜电子传递。尽管目前关于外膜电子传递的机制还不甚清楚,但有一个共同的认识是,无论是将电子直接传递至不同的电子受体或是传递至可溶性的电子穿梭体,外膜蛋白细胞色素c(OMc-Cyt)在这一过程中扮演着至关重要的角色[19]。MtrB接受MtrA的电子,并传递给外膜蛋白OmcA和MtrC,后两者通常被认为是Shewanella胞外电子传递的末端还原酶。

图1 S.oneidensis MR- 1胞内电子转移机制Fig.1 Intracellular electron transfer mechanism by S.oneidensis MR- 1

2.1 CymA

CymA(SO_4591)参与Shewanella的厌氧呼吸过程,含4个血红素,与NapC/NirT结构类似,其N端镶嵌于内膜蛋白,C端连接4个血红素延伸至周质蛋白中(图1)。CymA是Shewanella中起重要呼吸功能的细胞色素,当缺失编码CymA的基因时,其最终电子受体的还原能力下降了80%—100%[20]。另有研究表明,厌氧条件下,CymA作为内膜蛋白中醌泵与终端还原酶的电子传递链的中间体,可以对周质蛋白中延胡索酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、DMSO及外膜蛋白的Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅴ)进行还原,但仅通过细胞色素c3才可将电子传递到MtrA(图1)[21-22]。而除去与内膜蛋白相联N端的CymA仍保留其还原延胡索酸的能力,却丧失对周质中间体细胞色素c3的还原[21, 23]。为进一步证明这个结果,以电极作为S.oneidensisMR- 1的电子供体对延胡索酸进行还原,结果表明85%的电子通过CymA传递到延胡索酸,仅有15%通过周质穿梭体传递到MtrA,这不仅说明FR的氧化还原电势要高于细胞色素c3,而且CymA-FR-MtrA在周质中形成了传递电子的复合体[23-24]。

2.2 MtrA

编码MtrA的基因为SO_1777,与编码MtrB (SO_1776)、MtrC(SO_1778)和OmcA(SO_1779)的基因位于同一基因群。MtrA位于周质蛋白中,含有10个血红素,在胞外电子受体的电子传递过程中起主要作用[18]。将缺失mtrA的突变菌株与野生菌株相比,突变菌株对柠檬酸铁及金属氧化物(Fe和Mn)的还原能力大大减弱,而对延胡索酸盐、硝酸盐、亚硝酸盐、DMSO、TMAO及硫代硫酸盐的还原没有影响,说明MtrA是胞外电子传递过程中必要的特异蛋白[16]。但MtrA位于周质内,并不能与胞外电子受体直接接触,因此,电子要通过周质蛋白应传递到MtrB。MtrB是一种不含血红素的跨外膜蛋白,作为保护鞘参与了MtrA和MtrC之间的电子传递,并促进OmcA和OmcB在MR- 1内的转移和定位,是金属氧化物还原过程中不可缺少的重要蛋白[17]。但MtrB如何将电子转移到外膜的过程尚不清楚。

2.3 MtrC和OmcA

MtrC和OmcA是位于外膜蛋白的脂蛋白,各含10个血红素[25-26],可将电子直接转移到胞外电子受体。与MtrA相同,缺失编码omcA或mtrC基因的突变体对可溶性电子受体的还原并无影响,但对胞外金属氧化物(Fe和Mn)还原能力显著下降,与野生菌株相比分别降低了45%和75%[27]。MtrC和OmcA都具有向胞外传递电子转移的能力,但在Shewanella的电子传递过程中MtrC要起到更主要的作用[28-29]。这一结果被Jimmy等[30]再次证明：在柠檬酸铁中培养缺失mtrC的突变菌株,发现其还原能力要明显低于缺失omcA的突变菌株,证实MtrC是柠檬酸铁的主要还原酶。这主要是由于：(1) MtrC稳定态的浓度要高于OmcA；(2)插入失活的OmcA会导致MtrC含量的增加,反之不成立；(3)OmcA与MtrC在动力学方面的行为模式不同；(4)MtrC是OmcA发挥功能的必要条件。此研究也首次证明,OmcA与MtrC是MR- 1中唯一能够将电子转移到Fe(Ⅲ)的细胞色素[30]。

缺失mtrC的突变体其外膜上细胞色素c的含量不足野生菌株的15%,说明mtrC对外膜其它细胞色素c的合成起到一定作用。对于缺失OmcA的突变菌株,MtrC仍可在胞质内合成OmcA,但不能使其转移到外膜[31]。为了进一步说明OmcA和MtrC在电子传递过程中的作用及关系,Liang 等[11]将两个多血红素细胞色素c从野生菌株中分离纯化后合成复合蛋白,由于复合体中MtrC∶OmcA为1∶2,也就是说外膜蛋白中至少含有30个血红素,OmcA和MtrC复合体柠檬酸铁的还原能力要远远高于其中任意单个蛋白,OmcA和MtrC在MR- 1的外膜蛋白中紧密结合成了一个稳定的蛋白复合物并在电子传递途径中发挥了重要作用。

OmcA和MtrC对不同电子受体的还原具有特异性,Shi等[11]将胞外电子受体V(Ⅴ)、U(Ⅵ)及Se(Ⅵ)作为Fe(Ⅲ)还原的竞争性底物,仅有V(Ⅴ)与Fe(Ⅲ)为共同的胞外电子受体时,Fe(Ⅲ)的还原效率会明显降低,而U(Ⅵ)和Se(Ⅵ)对Fe(Ⅲ)的还原并无显著影响,因此在OmcA和MtrC对U(Ⅵ)及Se(Ⅵ)的还原并不起主要作用。

2.4 T2SS

T2SS (Type Ⅱ secretion system) 是Shewanella的蛋白分泌系统,在胞外电子传递中也起到十分重要的作用(图1)。T2SS由多种蛋白组成,如GspD、GspE与GspG[32]。研究表明,插入失活的gspE的突变体对Fe(Ⅲ)或Mn(Ⅴ)的还原能力减弱,这也是首次证明了T2SS参与了金属氧化物(Fe和Mn)的还原[33]。随后Shi[34]首次证明了T2SS在MtrC与OmcA的转移中起到了直接作用,缺失编码T2SS的基因丧失了培养基中S.oneidensis释放MtrC和OmcA的能力；并且缺失T2SS的S.oneidensisMR- 1突变体与缺失mtrC/omcA突变体有相似的表型,导致其突变体在生物电池中的产电能力下降[35]。MtrC和OmcA向外膜转移的顺序为[34]：(1)在胞质内合成；(2)通过Sec途径跨过内膜；(3)在周质内成熟；(4)通过T2SS转移到外膜。

2.5 电子转移模块

对于S.oneidensisMR- 1,单个基因或多个基因(cymA或mtrABC)的敲除并不完全使电流消失,说明在电子传递过程中还存在其它可以代替上述蛋白的结构。基因组分析表明编码MtrABC的一系列同族蛋白在相同的操纵子上可编码。其中MtrA的同族蛋白包括MtrD、DmsE与SO4360；MtrC的同族蛋白为OmcA和MtrF；MtrB有3个同族蛋白分为MtrE、dmsF与SO4359。这些同族蛋白组成的电子转移模块也可将电子从醌池转移到胞外的电子受体,但其发挥的作用各不相同[36]。目前已经对其中外膜电子传递通道中的一种十血红素辅基细胞色素(MtrF)进行了X射线晶体结构解析。根据这个结构模型,可以研究不同类型的胞内电子传递或解析可能的胞内电子传递发生机制。MtrF晶体结构的解析第一次确定了10个血红素的空间排布构型,其中血红素以一种独特的交叉构型贯穿在4个结构域(Domains I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)中[37]。这个结构可以为人们提供分子水平研究的可能性,用于分析胞外呼吸菌如何还原不溶性底物(如矿物)、可溶性底物(如黄素)以及与细胞表面不同氧化还原细胞色素终端之间形成的电子传递链[37]。

通过其不同基因缺失的突变体对柠檬酸铁的还原可知,在MtrA和OmcA存在的条件下,MtrD促进了电子的传递,而SO4360在电子传递过程中的贡献较少,也就是说在功能上,MtrA的同族蛋白可取代MtrA,其还原柠檬酸铁的顺序为MtrD > DmsE >> SO4360。缺失mtrF的突变菌株对柠檬酸铁的还原量与野生菌株相差不大,但对黄素及可溶性电子受体的还原能力要强于OmcA和MtrC,而MtrE在功上可替代MtrB。MtrDEF在Shewanella中形成了与MtrCBA重叠或交叉的呼吸网络,对Shewanella的极端厌氧呼吸过程而言也起到至关重要的作用[36]。

Shewanella中最主要的电子传递模块是MtrCAB,由基因omcA-mtrCAB编码,位于外膜的细胞色素c(MtrC与OmcA)可将电子直接传递到胞外受体,但由于外膜的宽度为40 Å,MtrA和MtrC位于外膜的两侧,电子无法从内膜直接传递到外膜,需要通过中间体传递电子MtrB来完成内膜与外膜间的电子传递[38]。Richard等[39]还提出了一种外膜蛋白组成的电子传递通道复合体的分子结构,由MtrC、OmcA、MtrA及MtrB构成,其中MtrA是基于两个五血红素辅基NrfB单体末端相连组成的[40],MtrC和MtrA嵌入孔蛋白的深度是未知的。目前实验方法还无法研究蛋白内沿着血红素组成的通道进行的电子传递过程,而高性能计算则可以从分子水平解析血红素分子之间电子传递的热力学和动力学性质[41]。采用这些蛋白组成独特的分子机器进行长距离的电子传输,转移电子的距离可以超过100 Å,这对于生物纳米技术设备的设计具有显而易见的科学意义。

3 G. sulfurreducens中参与电子转移的细胞色素c

Geobacter的电子传递机制与Shewanella存在较大差异,Shewanella可产生电子穿梭体将电子间接传递到胞外受体,而Geobacter则需要与胞外受体直接接触才可使其还原[42-44]。二者胞内细胞色素c种类与功能也各不相同,G.sulfurreducens的细胞色素c中含有100多个基因,并产生大量的细胞色素c,远多于S.oneidensisMR- 1[10]。其中参与胞外电子传递细胞色素c包括MacA(位于内膜表面与胞质相连[45])、PpcA(存在胞质中[46]),以及位于外膜蛋白的OMCs(包括OmcB、OmcE、OmcS及OmcZ)(图2)[47]。图2比较了ShewanellaMR- 1 和G.sulfurreducens胞外电子传递链的组成。

图2 G. sulfurreducens胞内电子转移机制Fig.2 Intracellular electron transfer mechanism by G. sulfurreducens

3.1 MacA和PpcA

MacA和PpcA是位于周质内的两个细胞色素c,它们将细胞色素的内膜与外膜相联,可使电子从周质传递到胞外的电子受体。MacA的分子量为35kDa[45]。X-射线衍射对MacA三维结构分析结果显示,它主要包含两个球状结构,其中各含一个亚铁血红素基团[42]。由于MacA表面带正电荷,可与细胞质膜中带负电荷的表面紧密相联,并通过PpcA将电子传递到外膜蛋白。基因macA在Fe(Ⅲ)作为最终电子受体时的表达能力要明显高于延胡索酸[45]。与野生菌株相比,缺失macA对氧化应激反应并无影响,而其还原Fe(Ⅲ)的能力明显降低,说明MacA是调节电子向Fe(Ⅲ)传递的主要蛋白。然而,随后的研究中表明,缺失macA的突变体并不能使电流完全消使,但omcB的反转录及蛋白质水平明显降低[48],并且omcB的反式表达使缺失macA的突变体对Fe(Ⅲ)的还原速率与omcB的表达成正相关。也就是说,MacA并不直接参与电子传递的过程,而是通过对omcB的表达调控间接影响胞外受体的还原能力[48]。而在近年来的研究中表明,MacA除可间接参与电子传递过程外,它与细菌细胞色素c的过氧化物酶也具有高度的相似性,说明MacA还是Geobacter在氧过量而发生中毒时可自身解毒的必要蛋白[49]。

PpcA位于周质内,分子量为9.6kDa,包含3个血红素和1个疏水信号肽,等电点为9.5,其N端的氨基酸序列与硫还原单胞菌中含3个血红素的细胞色素c7紧密相联[46]。缺失ppcA的突变体对延胡索酸还原影响并不显著,而对Fe(Ⅲ)、AQDS及U(Ⅵ)的还原速率明显降低,因此PpcA作为周质中的电子载体,可将电子传递到外膜蛋白的最终还原电子受体如Fe(Ⅲ)还原酶、腐殖质、AQDS及金属氧化物(Fe和Mn)。PpcA的4个同源蛋白也位于周质内,分别为PpcB、PpcC、PpcD及PpcE,与PpcA氨基酸序列的相似度分别为77%、62%、57%和65%[46]。在缺失ppcA时,PpcB-E的含量增多,可部分补偿PpcA的缺失。而缺失ppcB-E,PpcA含量也会增多,而且其还原可溶性Fe(Ⅲ)的量要高于野生菌株,说明PpcA是周质中最有效的电子载体[46]。

3.2 OmcB

OmcB是第一个被发现对可溶性Fe(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)氧化物都有还原能力的细胞色素c[50]。为进一步证明这一观点,微阵列分析表明omcB的反转录水平与它在Fe(Ⅲ)氧化物及柠檬酸铁的生长程度类似,说明两种受体分别被还原时,OmcB蛋白的含量相当[51]。这种高分子量的细胞色素c具有12个可与亚铁血红素结合的位点,其N端含有10个氨基酸脂蛋白信号肽,位于外膜蛋白,部分暴露于胞外空间。OmcC是OmcB唯一的同源蛋白,二者相似度为73%,但它并不参与Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅴ)的还原[50]。缺失omcB的突变体对可溶性Fe(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)氧化物的还原能力都大大降低,说明电子传递从周质到OmcB的传递过程是Fe(Ⅲ)还原的重要途径,但对Mn(Ⅴ)的还原并无影响,也就是说,电子从胞内转移递到Mn(Ⅴ)还可能存在多种其它途径[50,52]。

3.3 OmcS和OmcE

OmcS和OmcE位于外膜蛋白,松驰的附着在细胞表面[47]。缺失omcS与omcE的突变体大大降低了Fe(Ⅲ)氧化物的还原能力,但对可溶性电子受体及柠檬酸铁的还原并无影响,因此缺失这两种蛋白并不影响电流的产生[28]。

OmcS是硫还原单胞菌中含量最丰富的细胞色素c,其分子量大小为50kDa,位于外膜蛋白,含有6个亚铁血红素。omcS(GSU2504)在Fe(Ⅲ)或Mn(Ⅴ)氧化物分别作为电子受体进行培养时,转录水平有很大提高,omcS的同族基因omcT(GSU2503)位于omcS的下游,二者具有相同的操纵子,氨基酸序列相似度为62.6%[53]。在Fe(Ⅲ)氧化物作为电子受体培养的菌株中,基因omcS与omcT转录水平均是以柠檬酸铁作电子受体的28.3倍；而Mn(Ⅴ)氧化物作子受体时,其转录水平分别是柠檬酸铁作电子受体13.8和52.2倍[52],OmcS还可促进电子从菌毛传递到Fe(Ⅲ)氧化物,说明OmcS是金属氧化物(Fe和Mn)的最终还原酶[54]。尽管omcT具有很强的表达能力,但OmcT在Fe(Ⅲ)氧化物生长的细胞蛋白质组中的含量并不丰富[28],并且缺失omcT对金属氧化物(Fe和Mn)的还原并无显著影响[55]。

OmcE(GSU0618)含有4个血红素,分子量大小为30kDa。在Fe(Ⅲ)氧化物电子供体时,细胞中omcE的转录水平是柠檬酸铁的3倍,但在Mn(Ⅴ)作为电子受体时,omcE的转录水平并没有升高[52]。有研究表明,缺失omcE会短暂抑制Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅴ)氧化物的还原,但随着时间增加,两种氧化物的还原能力又恢复到正常水平。因此,与OmcS相比,OmsE不是Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅴ)氧化物还原必要的蛋白[55]。免疫定位研究表明,在Fe(Ⅲ)氧化物作电子受体时,细胞中OmcE的含量要明显低于OmcS,而且OmcE与OmcS不同,OmcS位于沿着电子传递方向的菌毛附近,可将电子直接传递到胞外,这也进一步说明了在金属氧化物的还原中,OmcE并不起主要作用[56]。

3.4 OmcF

OmcF(GSU2432)位于外膜蛋白,只含1种血红素,分子量大小为10kDa,其结构与光合藻类Monoraphidium中细胞色素c6高度类似,是一种参与在光合作用中电子传递的细胞色素c[57]。研究表明,omcF参与了omcB的表达,缺失omcF使omcB转录水平大大降低,Fe(Ⅲ)的还原能力也有所下降[58]。缺失omcF的突变株在以Fe(Ⅲ)氧化物作为电子受体时的生长状态明显降低,而以Mn(Ⅴ)作电子受体时并没有影响[52]。产生这一结果的原因是由于omcF的缺失直接或间接影响omcB的表达能力,导致Fe(Ⅲ)的还原能力降低,由于omcB并不是Mn(Ⅴ)还原的主要途径,因此缺失omcF对Mn(Ⅴ)的还原并无影响。

3.5 OmcZ

OmcZ(GSU2076)是一种与细胞外基质相联的细胞色素c,并不存在于所有Geobacter中,OmcZ有两种存在形式：OmcZL(50kDa)和OmcZs(30kDz),而对其亚细胞定位研究表明,OmcZs是OmcZ胞外存在的主要形式,包含8个血红素,其氧化还原电势从-420到-60mV[59-60]。OmcZL在周质和外膜内完成转移后的修饰加工,而大多数的OmcZs存在于细胞外基质[59]。在以石墨电极为唯一的电子受体时,OmcZ是产电过程中最重要的细胞色素,缺少omcZ的突变体使电流减少90%以上,但它并不参与延胡索酸盐、柠檬酸铁或Fe(Ⅲ)氧化物的还原[61]。近年来研究发现,OmcZ在Mn(Ⅴ)氧化物作为电子受体时的生长数量明显增多[52],也就说明OmcZ可还原Mn(Ⅴ),但不能还原Fe(Ⅲ),这与Kengo等[59]的研究结果一致,由于Mn(Ⅴ)氧化物的中点电位在25℃,pH值为7时可达到500—600mV,远高于OmcZ(-220mV),而OmcZ与Fe(Ⅲ)氧化物中间电位(-300mV)相差不大,因此OmcZ可快速将电子传递到Mn(Ⅴ)。但缺失OmcZ的突变株对Fe(Ⅲ)及Mn(Ⅴ)的还原并没有影响[52],说明OmcZ也不是参与Mn(Ⅴ)还原的主要细胞色素c。

3.6 OmpB和OmpC

OmpB和OmpC不属于细胞色素c,它们是由硫还原单胞菌中的4个基因编码的多铜氧化酶蛋白,OmpC与生盘纤发菌中的MofA较为接近,它是参与Mn(IV)氧化的功能蛋白[62-63]。而OmpB与枯草杆菌中的漆酶较为类似[64-65],位于细胞外基质,OmpC与它相邻[66]。因此这两种蛋白具有将电子传递到胞外不溶性电子受体的潜力。在G.sulfurreducens中,这两种基因对Fe(Ⅲ)或Mn(Ⅴ)的还原起重要作用[66-67]。基因芯片分析表明,ompB对Fe(Ⅲ)及Mn(Ⅴ)的还原起主要作用,而ompC仅参与Fe(Ⅲ)的还原,其还原能力相对ompB较弱[52]。

3.7 T4P

相比Shewanella需要利用OmcA与MtrC来进行胞外的电子传递,Geobacter则利用菌毛将电子从外膜蛋白传递到胞外电子受体[68]。研究表明,G.sulfurreducens上的菌毛具有强导电性,并不需要与胞外不溶性电子受体直接接触,它具有作为纳米导线的潜在作用,可利用纳米导线将电子从胞内传递到胞外受体[69]。硫还原单胞菌中T4P(Type Ⅳ pili)是电子到达胞外受体有效的传递方式[69]。T4P直径为60—90Å,长度1μm,由上千种菌毛蛋白构成[70]。T4P高度保守的N末端α-螺旋作为高度聚合域,菌毛的表面结构由C末端可变的球状域形成,并决定了菌毛的多种功能[70]。将丧失形成菌毛的突变体培养在以不可溶的Fe(Ⅲ)作电子接受体的培养基中,发现其不能还原Fe(Ⅲ)。还有研究表明,野生菌株对U(Ⅵ)的还原能力也明显强于丧失产生菌毛的突变体。PliA还促进蛋白的转移,因此缺失pilA,其突变体中外膜上相关的细胞色素c不能够准确定位。

4 存在的问题与研究展望

尽管目前已经清楚了S.oneidensisMR- 1与G.sulfurreducens胞内电子传递过程及其位于内膜、周质和外膜上的部分细胞色素c在胞内电子转移中的功能与相互关系,但对胞外呼吸菌胞内电子转移过程的研究还有许多问题尚未解决。首先,MtrB是否促进了电子从外膜传递到细胞表面这一点仍然是不确定的,MtrB结构及功能的研究是必要的,以揭示其是否直接参与了电子传递过程；其次,电子从外膜蛋白CymA到MtrA是如何传递的,在周质参与其转移的蛋白有哪些尚未完全确定。细胞色素c具有专一性,参与电子传递的细胞色素c可识别位于胞外不同的电子受体,但胞外呼吸菌是如何通过调节自身的分子结构来改变其参与电子传递的蛋白组分或采用不同的电子转移途径来进行识别的,这一问题也仍是未知。G.sulfurreducens的外膜蛋白及纳米导线是电子传递过程中重要的组成部分,可介导不同菌群间直接或间接的电子传递,研究表明Geobacter与产甲烷菌为共生关系并且两种菌群之间可进行电子传递,但大多数的产甲烷菌并不含有细胞色素c[71],因此,对于不含细胞色素的菌群,Geobacter与Shewanella是利用何种机制相互识别并进行传递电子的,这一过程也需要进一步研究。在复杂条件下进行胞外电子传递时,同一种微生物胞内电子传递过程中参与的蛋白及传递机制是否相同,哪些蛋白参与其主要作用以及由哪些菌群协同完成还有待于进一步研究。现阶段研究的胞外呼吸菌仅占自然界极小部分,胞内电子传递机制的研究也仅限于Geobacter与Shewanella。因此,要分离出更多的胞外呼吸菌,完善其参与电子传递链重要组分及细胞色素c的分子学机制,并研究其在多种复杂条件的胞外电子传递过程,才可有效解决污染物的难降解和微生物产电效率低等实际问题。

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Intracellular electron transfer mechanism of typical extracellular respiratory bacteria

ZHAO Xinyu1,2,3, HE Xiaosong2,3,4,*, TAN Wenbing2,3, GAO Rutai2,3, XI Beidou1,2,3, LI Dan2,3, ZHANG Hui2,3

1CollegeofWaterScience,BeijingNormalUniversity,Beijing100875,China2StateKeyLaboratoryofEnvironmentalCriteriaandRiskAssessment,ChineseResearchAcademyofEnvironmentalSciences,Beijing100012,China3InnovationBaseofGroundWater&EnvironmentalSystemEngineering,ChineseResearchAcademyofEnvironmentalScience,Beijing100012,China4CNHOMELANDEnvironmentalProtectionWaterPollutionGovernanceAcademicianWorkstation,Guangzhou510631,China

The reduction of humus and metals such as Fe and Mn is a challenge for microorganisms, as these substances have low water solubility and cannot enter into cell envelopes. Extracellular electron transfer is defined as the process through which electrons derived from the oxidation of electron donors are transferred from the inner membrane to the outer membrane of the cell to reduce an extracellular terminal electron acceptor.S.oneidensisMR- 1 andG.sulfurreducensare the most frequently used organisms for extracellular respiratory bacteria experiments because they have developed electron transfer strategies that require mutihemec-type cytochromes (c-Cyts). InS.oneidensisMR- 1, multihemec-Cyts, CymA, and MtrA are believed to transfer electrons from the inner membrane qunione/quinol pool through the periplasm to the outer membrane (OmcA, MtrC). The Type Ⅱ secretion system ofS.oneidensisMR- 1 was due to the direct involvement of translocation of MtrC and OmcA to the bacterial cell surface. The decahemec-Cyts, MtrC, and OmcA can directly reduce the extracellular electron acceptors. Likewise, forG.sulfurreducens, MacA delivered electrons from the inner membrane to PpcA in periplasm, and PpcA subsequently transferred electrons to the OMCs (OmcB, OmcE, OmcS, and OmcZ) and Type Ⅳ pili that were hypothesized to relay the electrons to extracellular electron acceptors. This review summarizes the recent advances of extracellular electron transfer mechanisms with a focus onShewanellaandGeobacter.

extracellular respiration; intracellular electron transfer;Shewanella;Geobacter

国家杰出青年科学基金项目(51325804)；国家自然科学青年基金项目(51408573)

2014- 12- 26; 网络出版日期:2016- 10- 29

10.5846/stxb201412262581

*通讯作者Corresponding author.E-mail: hexs82@126.com

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