兔耳创伤后创面早期外用干扰素与法舒地尔预防瘢痕增生的实验研究

罗坤　乔柱

[摘要]目的：本实验观察兔耳创伤后创面立即外用干扰素与法舒地尔预防瘢痕增生的疗效。方法：选择健康的新西兰大耳白兔，制作兔耳创伤模型48只，随机分为A，B，C三组，每组16只共计32个创面，A组外用干扰素霜，B组外用法舒地尔霜，C组为生理盐水对照组。术后第一天起用药至4周后兔耳上皮化，切取瘢痕组织计算瘢痕增生指数，观察masson染色胶原纤维的形态分布及成纤维细胞数量。结果：A组与B组之间差异有统计学意义（P<0.05），A组与C组、B组与C组之间差异皆具有统计学意义，差异显著（P<0.01）。结论：兔耳创伤后创面立即外用干扰素与法舒地尔能有效预防抑制瘢痕增生。

[关键词]干扰素；法舒地尔；创伤；成纤维细胞；增生性瘢痕；实验研究

[中图分类号]R619⁺.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0074-03

增生性瘢痕是整形外科研究的难点和热点，临床治疗较为困难，一般采用手术切除辅以其它方法如药物注射、激光、按摩、加压、硅凝胶膜等。经临床证实如干扰素，钙通道阻滞剂等药物较为有效。Lee，京萨等通过一系列研究证实肌注或者外用钙通道阻滞剂均能有效抑制兔耳瘢痕增生。依此，本实验利用兔耳作为瘢痕模型，对兔耳创伤后即用干扰素与法舒地尔至创面上皮化愈合，观察其预防抑制瘢痕增生的疗效。

1材料和方法

1.1实验动物：本实验兔48只由雅安职业技术学院实验中心提供，兔龄8～12个月，兔耳完好，雌雄不计，体重为2.0～2.5kg。

1.2实验仪器和试剂：实验所需手术的器械由雅安职业技术学院动物实验中心提供，相机（自备），干扰素（北京凯英科技有限公司），盐酸法舒地尔（成都华宇制药有限公司），0.9%氯化钠注射液（成都青山利康药业有限公司）。

1.3创伤模型的制作：依据李荟元研究设计的瘢痕模型制作方法，将兔耳腹侧全层皮肤去除1.5cm×1.5cm，并刮除其软骨膜。

1.4实验动物分组：将48只实验兔随机分成3组，每组16只，每只兔耳造模一个共创伤模型32个。实验组A组外用干扰素α-2b（将凡士林99g加1g干扰素α-2b注射液，制成1%的干扰素α-2b霜），B组外用法舒地尔（将凡士林99g加1g法舒地尔注射液，制成1%的法舒地尔霜），C组生理盐水为对照组（将凡士林99g加1g无菌生理盐水，制成1%的生理盐水霜）。

1.5用药方法：术后第1天，A组外用干扰素α-2b霜每日1次均匀薄层涂抹在创面上，至兔耳上皮化愈合共计4周。B组每日1次外用法舒地尔霜与C组每日1次生理盐水霜，至兔耳上皮化愈合共4周。

1.6标本切取及处理：实验第29天处死实验动物，在严格无菌条件下切取兔耳标本，带有部分正常皮肤软组织和软骨膜。10%的甲醛溶液固标本定，石蜡包埋，进行HE染色和Msson染色。

2观察指标

2.1大体方面观察：每天观察并拍照记录创面肉芽生长、创面愈合后瘢痕形成情况如：组织的颜色、质地、大小、厚度等。分别在实验第7天、14天、28天记录数据并分析，在第28天时创面上皮化，大体表现：根据温哥华瘢痕评分标准记录评分。

2.2瘢痕增生指数（HI）测量：在低倍镜下测微尺测出正常皮肤表面至软骨表面的厚度b，测出瘢痕表面至软骨表面的厚度a，依据Morris等提出的瘢痕增生指数HI=a/b即得出结果。

2.3成纤维细胞计数FBh在HE染色标本中，低倍显微镜下寻找显示最清楚、成纤维细胞数最多的区域，通过高倍镜下观察4个不重复的不同区域视野并目测计数，得到的结果取均数，此数即为该实验动物的成纤维细胞数目（Weidner法）。

3统计方法

本实验采用PASW Statistics18（SPSS18.0）软件进行统计分析，组间比较采用了t检验，并且按检验水准a=0.05，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01差异显著；P>0.05则差异无统计学意义，可认为实验组与对照组对瘢痕的预防抑制作用无明显差异。

4结果

4.1一般观察：实验第28天时，创面皆愈合形成瘢痕，干扰素和法舒地尔不影响创面的愈合，且愈合时间差异无统计学意义。实验A组：肉眼可见瘢痕不超过手术范围，瘢痕质地平软，颜色淡，斑块体积小；B组：瘢痕不超过手术范围，质地稍平软，颜色稍淡，斑块体积较小；C组：瘢痕增生高出皮肤表面但不超过手术范围，质地硬，颜色红，瘢痕斑块体积大。

4.2 HE染色观察：A组、B组镜下可见创伤区表皮和真皮稍显增厚，细胞层次少，表皮的厚薄程度不均，瘢痕厚度略高于周围正常皮肤，瘢痕内可见呈梭形成纤维细胞和炎细胞；C组表皮和真皮增生明显，细胞层次明显增多，可见大量不规则的梭型成纤维细胞呈漩涡状，可见大量的成纤维细胞和炎细胞浸润。

4.3 Masson染色观察：A组、B组Masson染色观察胶原致密，形态纤细，胶原纤维排列整齐；C组胶原纤维蓝染颜色深，胶原酥松粗大，胶原纤维排列紊乱。

4.4瘢痕增生指数及成纤维细胞计数比较：软件分析统计结果如表1、表2。由表1可见：实验A组和实验B组比较P<0.05，差异有统计学意义，实验A组瘢痕增生不明显，实验B组轻度瘢痕增生。实验A组、B组和对照C组比较P<0.01，C组瘢痕增生明显。由表2可见：实验A组和实验B组比较P<0.05，差异有统计学意义，实验A组成纤维细胞计数少于实验B组。实验A组、B组和对照C组比较P<0.01，A组、B组成纤维细胞计数明显少于C组。

5讨论

深度创伤后创面成纤维细胞大量增生，胶原纤维基质过度沉积导致皮肤纤维化，形成突出表面的瘢痕组织。增生性瘢痕之所以治疗困难，是因为至今没有一个很好的研究模型，对发病机理不清。建立有效的动物瘢痕模型为研究瘢痕提供可靠的方法，李荟元研究探索兔耳作为研究瘢痕的动物模型。朱桂英等进一步研究如何选择兔耳创伤部位及深度，术后处理方法，为增生性瘢痕的研究提供了成功率更高的兔耳模型。在兔耳可作为有效的瘢痕模型的研究背景下，对兔耳创伤后即用干扰素与法舒地尔至创面上皮化愈合，观察其预防抑制瘢痕增生的疗效。

干扰素可诱导细胞分化，抑制合成胶原蛋白并促进其降解，抑制成纤维细胞的增殖，拮抗转化生长因子β的正性调节作用，抑制α平滑肌肌动蛋白的合成，从而抑制瘢痕增生。钙通道阻滞剂主要作用于多种酶如：Rho激酶（三磷酸鸟苷结合蛋白，可抑制细胞增殖，参与重构细胞骨架，在细胞分化迁移凋亡发挥作用）、MLCK（肌球蛋白轻链激酶，属于钙调素依赖酶，催化肌球蛋白磷酸化，激活肌球蛋白ATP酶引起平滑肌收縮）、PKA和PKC（cAMP依赖蛋白激酶A、C使肌细胞生成素磷酸化，抑制肌细胞生成素与DNA的结合能力，阻止细胞分化为肌纤维）等多种酶，抑制细胞内游离钙离子活动，减轻炎症反应从而减轻组织损伤。许宁等研究表明，钙通道阻滞剂维拉帕米增强Smad7的表达，抑制成纤维细胞α-Smad7mRNA及合成细胞外基质。刘冲等认为，钙通道阻滞剂维拉帕米能够改变损伤处血管分布影响瘢痕形成。盐酸法舒地尔为新型钙通道阻滞剂，通过抑制Rho激酶、抑制PKA、C活性，减轻组织重构，有效地抑制成纤维细胞的增殖而抑制瘢痕。

本实验从大体及细胞学对兔耳创伤后创面立即外用干扰素与法舒地尔进行研究，干扰素与法舒地尔皆能预防抑制瘢痕增生，干扰素抑制瘢痕的作用强于法舒地尔，但干扰素副作用较多，不能诱导成纤维细胞凋亡而易复发；法舒地尔副作用少，对健康皮肤无明显副作用而优于干扰素。本实验表明，兔耳创伤后创面立即外用干扰素与法舒地尔能预防抑制瘢痕增生，但还有待进一步研究如用药频次、用量以及用药的最佳浓度和停药后治疗效果的观察。