肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症大鼠造模方法的建立与评价*

廊坊卫生职业学院

贾云波 杜惠兰△ 姚颖玉(廊坊 065001)



肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症大鼠造模方法的建立与评价*

廊坊卫生职业学院

贾云波 杜惠兰△姚颖玉(廊坊 065001)

目的：研制肾阳虚血瘀证子宫内膜异位症(EMT)病证结合大鼠模型，以供EMT中医药实验研究应用。方法：模拟妇科“冒雨涉水，感受寒邪”的病因，依据“寒邪伤阳”的中医理论，与传统的“自体移植”EMT动物模型相结合，建立病证结合的肾阳虚血瘀证EMT动物模型。依据冷冻时间长短及前后顺序行3种不同的造模模式。冷冻1个月，行EMT造模，再冷冻1个月设为“冷冻+造模+冷冻”组；冷冻1个月，行EMT造模后不冷冻为“冷冻+模型”组；先不冷冻，行EMT造模后，再冷冻1个月，设为“造模+冷冻”组，另设假手术组。用理化检验指标评价该模型的临床符合度。结果：与冷冻+模型组、造模+冷冻组、假手术组比较，冷冻+造模+冷冻组EMT的大鼠模型能反映肾阳虚血瘀证的中医基本证候特征，与EMT的疾病特点相符合。结论：冷冻+造模+冷冻方法是理想的肾阳虚血瘀证EMT实验模型。

肾阳虚血瘀证；子宫内膜异位症；大鼠模型; 痛经; 月经不调; 不孕; 癥瘕; 寒邪伤阳

子宫内膜异位症(EMT)简称内异症，是指子宫内膜组织在子宫内膜以外的部位出现、生长、浸润、反复出血，可形成结节及包块，引起疼痛和不育等，是临床常见病、多发病，目前该病的发病机制尚未明确。中医无EMT的病名，根据EMT的临床表现，本病应属于“痛经”“不孕”“癥瘕”“月经不调”等疾病范畴。中医证候动物模型的建立与研究是连接中医基础和临床的桥梁与纽带，对临床研究及治疗具有重要的指导作用。[1]本课题模拟妇科“冒雨涉水，感受寒邪”的致病因素和感邪途径，依据“寒邪伤阳”的中医理论，运用徐丁洁[2]“延长冰箱冷冻加冰水浸泡”结合EMT“自体移植法”建立肾阳虚血瘀证EMT大鼠造模，根据造模后大鼠宏观表现及理化指标检测结果，选择理想的肾阳虚血瘀证EMT的模型，以供临床实验研究用。本实验于2014年3月至2014年7月在河北中医学院实验室完成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：选取40只健康SD大鼠(河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：1407014)，雌性，清洁级，鼠龄3个月，体质量(200±20)g，大鼠适应性饲养1周后进行实验。饲养室通风良好，饲养期间给予大鼠标准颗粒饲料，自由饮水。

1.1.2 试剂、仪器：睾酮放免试剂盒(TRG41409，天津九鼎医学生物工程有限公司)、孕酮放免试剂盒(TRG51409，天津九鼎医学生物工程有限公司)、雌二醇放免试剂盒(TRG61409，天津九鼎医学生物工程有限公司)；庆大霉素(批号：1405081，天津金耀有限公司)、 PRECIL普利生(北京普利生仪器有限公司)、LBY-N7500B全自动血液流变仪(北京普利生仪器有限公司)、 BCD-257SL B 4℃海尔冰箱；欧姆龙电子体温计MC-145；三洋SANYO SIM-F140AY65制冰机(上海启步生物科技有限公司)、普通光学显微镜(上海光学仪器厂)、称重仪。

1.2 分组与造模

1.2.1 分组:40只健康SD大鼠按随机数字法分为4组，每组10只。设实验组3组，分别为冷冻+造模+冷冻(冷造冷)、冷冻+造模(冷造)、造模+冷冻(造冷)组；另设假手术组(对照组)。

1.2.2 虚寒型大鼠造模：用冷冻方法造模,大鼠5只一笼，每组2笼，笼中加0～1℃冰水，深度为150 mm，置于4℃冰箱中，2次/d(固定时间9：00 am及9：00 pm)，20 min/次，共30 d。冷造组大鼠，先行冷冻，然后子宫内膜移植造模；冷造冷组先行冷冻，然后子宫内膜移植造模，再行冷冻；造冷组先行子宫内膜移植造模，再行冷冻；假手术组大鼠常规饲养，未行任何方法造模。造模大鼠从冰水中取出后独笼饲养，观察二便情况，并用涂有凡士林的欧姆龙电子体温计探头插入直肠约1 cm测温，待体温计显示数字后取出，记录数据。当大鼠体温降低(范围36.8～37.6 ℃,低于对照组，差异并有显著性)、阴道细胞涂片显示动情周期紊乱时，提示虚寒型大鼠造模成功。

1.2.3 子宫内膜移植造模：待统一的动情间期(阴道涂片以白细胞为主)，冷造冷组、冷造组、造冷组大鼠行“自体移植法”EMT造模，[3]将实验3组大鼠分别称重后，3%水合氯醛麻醉，待麻醉满意后，将大鼠仰卧位，头部及四肢固定在手术板上，取下腹部5×4 cm大小的皮肤备皮，腹部剪毛。在无菌条件下开腹，取下腹正中切口长 1.5 cm，进入腹腔后分离子宫，结扎子宫系膜上的血管，再结扎需要切除子宫的两端，取中间段 2 cm，将切下的子宫组织迅速放入装有PBS溶液的玻璃皿中，再将其纵向切开，纵行剪开宫腔，剥离宫内膜，将剥离的宫内膜剪成等大的两块，分别缝合于左侧卵巢、左侧腹膜壁层，检查腹腔内无出血，逐层缝合腹壁及皮肤，关腹前腹腔内注射庆大霉素0.1 mL。将剩余的内膜组织进行组织学检查，以证实移植物为子宫内膜。术后让大鼠自然苏醒，分笼单放，常规饲养不冷冻。术后3 d连续肌肉注射庆大霉素，0.1 mL/只，1次/d。术后第4 d开始冷冻，冷造冷、造冷组的大鼠连续冷冻30 d，方法同前。假手术组仅行开腹手术，但不移植子宫内膜。冷造组及假手术组大鼠常规饲养。

1.3 观察指标与方法 每天上午、下午各做阴道涂片1次以确定动情周期，待统一动情间期，禁食24 h后，待麻醉满意后，处死大鼠。行股动脉取血3 mL，分离血清，-20℃冰箱保存待测。冰浴条件下剖腹观察异位内膜生长的情况，无菌操作迅速取下胸腺、脾脏、子宫，去掉脂肪组织，吸去血迹后称重待测。

1.3.1 大鼠一般情况：肉眼观察大鼠外观变化。

1.3.2 大鼠盆腔改变：大体肉眼观察。外观、毛色、精神、反应、二便情况。

1.3.3 性激素检测：放射免疫分析法(用放射性核素标记待检测物质，通过仪器对放射性物质的接收对待测物质进行定量检测)检测血孕酮、雌二醇、睾酮。

1.3.4 血液黏度的检测：应用北京普利生仪器有限公司LBY-N7500B全自动血流变仪直接检测(一种血液临床检测仪器，直接对血液样本进行检测)。

1.3.5 脏器指数的计算：冰浴条件下剖腹观察异位内膜生长的情况，无菌操作迅速取下胸腺、脾脏、子宫，去掉脂肪组织，吸去血迹后称重，计算脏器指数。脏器指数=脏器湿重(mg) /体质量(g) 。

2 结果

2.1 一般状况比较 实验过程中，假手术组大鼠的外观无明显差异，毛色白，有光泽，精神佳，活泼，反应灵敏，饮食、二便均正常，辅料3天更换1次，不湿。冷造冷组大鼠身脏毛污明显，反应迟钝,懒动，行动缓，寒战，爪色白，呼吸弱，被毛无光，饮水少，大便溏。冷造组及造冷组大鼠出现身脏毛污，反应迟钝，蜷缩懒动，后肢行动迟缓、寒战，扎堆怕冷、爪尾部苍白，尾部皮下瘀紫、耳色苍白，呼吸微弱，被毛无光泽，饮水量少，大便稀溏等，实验3组的辅料2天更换1次，较湿。根据临床上EMT患者表现为经行腹痛，月经先后不定，经量或多或少，经色黯，或有血块，不孕，盆腔结节包块，面色晦黯，腰膝酸软，性欲减退，畏寒等症状，冷造冷组大鼠的表现与临床患者症状接近。

2.2 各组盆腔异位灶观察比较 肉眼见冷造冷组移植物生长良好，体积明显增大，呈隆起黯红色或透亮的小囊状，内部充满积液，表面血管清晰可见，异位组织周围血管丰富，有些异位组织与周围组织黏连；冷造及造冷组移植物体积较小，表面血管细，异位组织周围血流差。

2.3 各组大鼠体温、体质量情况比较 大鼠行虚寒型造模30 d，冷造冷组、冷造组大鼠体温较造冷组及假手术组大鼠体温降低，统计处理后，冷造冷组大鼠体温与冷造组、造冷组、假手术组大鼠比较差异有显著性(P<0.05)。行EMT造模后，继续虚寒造模30 d，冷造冷组与造冷组大鼠体温比较差异无显著性(P>0.05)，冷造冷组与冷造组、假手术组比较差异有显著性(P<0.05)；大鼠行虚寒型造模30 d，各组大鼠体质量有所增加，但冷造冷组、冷造组、造冷组大鼠上体质量升缓慢，经统计学处理后，冷造冷组与造冷组、冷造组、假手术组大鼠体质量差异有显著性(P<0.05)；行EMT造模成功后，从术后第4 d开始继续虚寒造模30 d，冷造冷组与造冷组、冷造组、假手术组差异有显著性(P<0.05)。详见表1。

组别n体温(℃) 冻30d 冻60d体质量(g) 冻30d 冻60d假手术组1038 22±0 2438 15±0 31211 6±3 58216 9±2 48冷造冷组1037 43±0 2337 21±0 30199 4±3 70206 1±2 07造冷组1037 84±0 2637 38±0 24204 4±4 17211 5±4 01冷造组1038 15±0 2438 11±0 20206 9±4 99211 3±4 19F值-22 0128 4515 0317 65P值-<0 05<0 05<0 05<0 05

2.4 各组大鼠血清性激素水平比较 实验取血后即进行激素水平检测。冷造冷组、造冷组、冷造组大鼠的雌二醇、孕酮、睾酮水平较假手术组大鼠均有降低，经统计学处理后，冷造冷组雌二醇水平与其余各组比较差异均有显著性(P<0.05)，冷造冷组、造冷组、冷造组、假手术组间睾酮、孕酮水平两两比较差异均有显著性(P<0.05)。详见表2。

组别n雌二醇(pg/mL)孕酮(ng/dL)睾酮(ng/dL)假手术组1033 56±3 1234 65±3 0636 58±2 36冷造冷组1022 02±3 2514 94±1 4310 46±0 97造冷组1026 16±3 9019 93±3 6917 2±34 11冷造组1029 05±2 5230 76±5 7129 18±5 04F值-28 2958 574 61P值-<0 05<0 05<0 05

2.5 各组大鼠血液黏度的比较 实验取血后即进行检测。4组大鼠全血黏度的低切、中切及高切间两两比较，经统计学处理后，差异均有显著性(P<0.05); 还原黏度的低切冷造冷组与其他3组两两比较差异有显著性(P<0.05)，冷造冷组与造冷组、假手术组中切比较差异有显著性(P<0.05)，冷造冷组与冷造组、对照组高切比较差异有显著性(P<0.05)。 详见表3。

2.6 大鼠脏器指数的比较 术中取组织即进行称重。冷造冷组大鼠脾脏指数与造冷组、冷造组、假手术组比较差异有显著性(P<0.05)；冷造冷组大鼠胸腺指数与造冷组、冷造组、假手术组比较差异有显著性(P<0.05)；冷造冷组、造冷组大鼠的子宫指数差异无显著性(P>0.05)，冷造冷组与冷造组、假手术组间子宫指数差异有显著性(P<0.05)，详见表4。

3 讨论

EMT是妇科常见疾病之一 。以月经失调、不孕、盆腔包块、盆腔疼痛为主要临床症状，育龄妇女中的发病率约为15%。[4]EMT是一种性激素依赖性和自身免疫反应性疾病。病证结合动物模型是探究疾病发生机制以及筛选有效治疗方法的关键途径和手段, 是深化证候物质基础认识的方法。由于伦理学等方面的原因,很难在EMT患者身上观察EMT发病的全过程,不能对人类进行对照研究,也不能进行损伤性研究。因此,建立理想的动物模型模拟人类EMT,以便进行反复的、可控的实验,在动物身上进行病因病理、药物治疗等的研究,才能有助于尽快地攻克疾病。[5]EMT动物模型的研究始于上世纪20年代。中医证候模型的研制始于20世纪60年代，至今已经进行了大量、多方面的探索，在近半个世纪的时间里，我国科研工作者共研制出了30余类100多种中医证候动物模型。[6]病证结合动物模型同时具有西医疾病和中医证候特征。[7]单纯的疾病动物模型缺乏中医证候在模型中的表达。[8]刘氏等[9]提出病证结合动物模型，具有客观性强、可信度高以及更贴近临床等特点，是证候动物模型发展的必然趋势。陈氏等[10]认为病证结合模型在中医临床与基础之间架起了桥梁，有助于中药、方剂作用机制的研究和满足新药开发的需要。用微观量化的指标去验证模型的证候属性具有客观性、可靠性，并且可以进行连续动态的监测，因此成为了当今研究的热点。[11]

组别n全血黏度低切(mpa s)全血黏度中切(mpa s)全血黏度高切(mpa s)还原黏度低切还原黏度中切还原黏度高切假手术组106 18±0 484 50±0 284 06±0 2211 32±1 069 63±0 628 76±0 26冷造冷组1011 41±1 216 29±0 235 28±0 1623 07±2 9112 69±0 569 97±0 38造冷组108 60±0 405 74±0 195 08±0 1417 17±0 5310 64±0 989 88±0 39冷造组107 72±0 515 23±0 364 59±0 2714 31±1 5610 54±0 789 35±0 35F值- 91 21 78 12 71 38 89 30 29 79 25 61P值-<0 05<0 05<0 05<0 05<0 05<0 05

组别n脾脏指数胸腺指数子宫指数假手术组101 54±0 091 76±0 051 53±0 16冷造冷组101 15±0 271 51±0 171 11±0 13造冷组101 41±0 131 62+0 141 21±0 20冷造组101 44±0 081 72±0 051 49±0 14F值-10 599 3416 75P值-<0 05<0 05<0 05

通过查阅国内外文献，多数学者认为“瘀血内阻冲任、胞宫”为EMT基本病机，然究其成因最终又与阳气不足，失于温化、冲任不畅有直接关系。根据中医学“审证求因”的方法论，分析本病患者病程长，“久病及肾”容易导致肾虚；患者多表现为腹部畏寒喜暖、甚至腰以下冰冷，当属虚寒。肾阳不足，虚寒内生，阳气不足血运迟滞，寒蕴冲任胞宫，恶血凝集，致使冲任气血失调，离经之血凝集而发病，因此，笔者认为“瘀血阻滞冲任、胞宫”是EMT的基本病机，肾虚血瘀是本病发生发展的病理基础。[12]陈氏等[13]通过临床流行病学调查显示：虚寒证发病影响最大的危险因素为房劳多产，其余依次是虚寒体质、感受寒邪、饮食失宜、情志所伤、过度劳累。因此，感受寒邪是妇科虚寒证发病的重要因素之一。本课题采用妇科“冒雨涉水，感受寒邪”的病因，依据“寒邪伤阳”的中医理论，运用“延长冰箱冷冻加冰水浸泡”结合“自体移植法”行肾阳虚血瘀证EMT的模型。近年来的研究显示，EMT患者存在血液黏度流变学的改变和免疫紊乱。血液黏度流变学改变及细胞和体液免疫功能的异常，引起子宫内膜细胞的黏附、种植、侵袭、新生血管的形成等，最终导致内膜组织在腹腔中种植、增生。

目前EMT的病证结合模型有：肖氏等创建肝郁型EMT大鼠模型。[14]冉氏等[15]采用使孕鼠流产、产褥期受寒、夹尾致痛等因素综合施加，结合EMT“自体移植法”疾病造模，建立肾虚血瘀证EMT不孕症动物模型。本课题采用多因素造模的方法，不仅使模型的制备符合中医理论，并且使模型的可靠性和稳定性更强。

本实验结果证实：实验组大鼠的免疫功能受到影响，观察大鼠的宏观表现，结合检测脏器指数、激素水平的结果符合虚寒证的一般症状，与临床报道相符。“瘀”是产生EMT系列症状及体征的主要原因。近年来研究表明：EMT存在不同程度的凝血机制障碍，血液指标的结果，符合血瘀证，与临床研究血瘀证患者的血液黏度指标会发生明显改变相一致，该模型从宏观大鼠表现及微观血液大鼠血液黏度指标两方面均符合肾虚血瘀证EMT。

综上所述，本研究所采用的“延长冰箱冷冻加冰水浸泡”的方法结合“自体移植法”创建的模型，成功模拟了虚寒证的病因和致病特点，且符合EMT的一般临床特点，通过综合的评价方法验证证候的客观存在，从而为病证结合动物模型建立提供新方法，为中医药治疗EMT的研究提供可靠的方法。

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[2]徐丁洁,成秀梅,杜惠兰.妇科虚寒证大鼠模型的创建[J].中国中西医结合杂志，2011,31(11): 1 519-1 521

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[15]冉青珍,陈万群.肾虚血瘀证子宫内膜异位症不孕症动物模型的建立与评价[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(l):130-132

(2017-04-06 收稿)

Establishment and Evaluation of Molding Method for Rats with Endometriosis of Kidney yang Deficiency and Blood Stasis Syndrome

Langfang Health Vocational College

JIAYun-boDUHui-lanYAOYing-yu(Langfang 065001)

Objective: to develop the models with endometriosis (EMT) of kidney yang deficiency and blood stasis syndrome for the study and application of EMT in TCM. Methods: simulating the cause of “wading in the rain and getting the cold evil” in gynecology, EMT models with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome were established on the basis of TCM theory “pathogenic cold impairing yang”, in combination with traditional “autotransplantation” EMT animal model. Three different models were set up according to the time and the sequence of freezing time. Frozen for 1 month, EMT models were made before being frozen for another month for “freezing+molding+freezing” group; frozen for 1 month, EMT models were made for “freezing+molding” group; EMT models were directly made before being frozen for 1 month for “molding+freezing” group; and the sham-operated group was also established. Physical and chemical indexes were used to evaluate the clinical compliance of the models. Results: compared to the other three groups, the models of “freezing+molding+freezing” group could reflect the TCM syndrome characteristics of kidney yang deficiency and blood stasis syndrome, which was consistent with the disease characteristics of EMT. Conclusion: freezing+molding+freezing method is the ideal experimental models for EMT with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome.

kidney yang deficiency and blood stasis syndrome; EMT; rat model; dysmenorrhea; irregular menstruation; infertility; abdominal mass; pathogenic cold impairing yang

*河北省科技厅资助项目：No.132777155；河北省中医药管理局资助项目：No.2014027

R271.11+3

A

1007-5615(2017)03-0009-05

△河北中医学院(石家庄 050200)通讯作者：姚颖玉，男，中国石油天然气集团公司中心医院中医科。