脐血间充质干细胞对肺纤维化大鼠MMP2/TIMP-1的影响*

左万里，黄积雄，邓冏睿，赵洁敏，周 伟，雷泽洪，黄炎明

(1.暨南大学附属江门中医院/江门市五邑中医院，广东 江门 529000； 2.中山大学附属江门医院/江门市中心医院，广东 江门 529000)

肺纤维化(Pulmonary Fibrosis)是多种病因引起的间质性肺疾病的终末期病变。近期研究发现，肺纤维化的发生与肺组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)表达失衡相关[1]。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一种具备多向分化潜能、趋化特性、免疫调节作用及旁分泌功能的干细胞，对MMP-2/TIMP-1具有调节作用。因此，我们选用博来霉素诱导建立肺纤维化大鼠模型，给予脐血间充质干细胞(CB-MSCs)对肺纤维化大鼠进行干预，观察CB-MSCs对肺纤维化大鼠MMP-2、TIMP-1水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

广东省医学实验动物中心提供雄性SPF级SD大鼠36只，随机分为3组，每组12只，分别为正常对照组(C组)、肺纤维化模型组(M组)及CB-MSCs治疗组(T组)。各组大鼠体重(203±34) g，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。脐血间充质干细胞由广州赛吉生物科技有限公司提供。

1.2 肺纤维化模型建立及MSCs移植

2%戊巴比妥溶液按50 mg/kg体重对各组大鼠进行腹腔注射麻醉，颈正中切口显露气管，C组大鼠于气管内注入0.1 mL生理盐水，M、T组大鼠分别于气管内注入以5 mg/kg体重配制的博莱霉素生理盐水溶液0.1 mL，注射后立即直立旋转大鼠2 min，使药物于肺内均匀分布。缝合皮肤，局部消毒后继续在原饲养环境下饲养[2]。次日C、M组大鼠经尾静脉注射生理盐水1 mL对照，T组大鼠经尾静脉注射CB-MSCs106。建模后第28 d及42 d分别处死各组大鼠的一半(分别记为C1、C2、M1、M2、T1、T2组)。

1.3 测定MMP-2、TIMP-1水平

取1 g右肺，剪碎后加入预冷的PBS溶液9 mL，然后用高速匀浆机以15 000 r/min充分匀浆，所得匀浆液离心15 min后收集上清500 ul，于-80°C低温冻存。待实验结束、所有标本采集完后，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法，同时批量检测肺组织MMP-2、TIMP-1水平。

1.4 大鼠肺组织病理标本制作及观察

左肺用生理盐水冲洗，浸泡于4%多聚甲醛缓冲液中固定，常规酒精脱水、石蜡包埋，制作HE、Masson染色切片。光镜下观察肺组织成纤维细胞、胶原纤维等肺间质结构病理改变情况。根据Szapiel等的方法，对HE染色切片评定肺组织肺泡炎程度，对Masson染色切片评定肺组织纤维化程度。肺泡炎分四级：(1) 无(-)；(2) 轻(+)：受累范围<20%，肺泡结构完整，肺泡间隔增宽，病变局限；(3) 中(++)：受累范围20%～50%；(4) 重(+++)：受累范围>50%，弥漫性肺泡炎，偶可见肺泡腔内细胞及出血造成的实变。肺纤维化分四级：(1) 无(-)；(2) 轻(+)：受累范围<20%，累及胸膜及胸膜下肺实质，肺泡结构发生紊乱；(3) 中(++)：受累范围20%～50%，肺纤维化从胸膜开始延伸，但仍属局部；(4) 重(+++)：受累范围>50%，弥散性肺纤维化、融合损伤并伴有广泛肺实质结构紊乱。等级资料转化为计量资料：-为0分，+为1分，++为2分，+++为3分。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况

C组大鼠一般情况良好，无死亡。M组造模后死亡2只，该组大鼠活动、饮食情况明显差于C组。T组在MSCs移植后死亡1只，但一般情况较M组好转。所有大鼠颈前伤口于造模3～4 d后自然愈合。

2.2 大鼠肺组织病理学观察

C1、C2组大鼠肺泡结构正常，未见明显炎症性或纤维化改变，无胶原纤维沉积。模型M1组大鼠肺组织HE染色可见肺泡间隔明显增宽，伴水肿、出血，大量炎性细胞浸润；Masson染色可见肺泡结构紊乱，随时间延长M2组的肺纤维化更为严重，伴大量蓝绿染色的胶原纤维沉积。治疗T1组的肺泡炎程度则显著减轻，Masson染色可见肺纤维化、肺泡间隔增宽程度较M1组改善，T2组蓝染胶原沉积显著减少，肺纤维化等改变亦较M2组明显减轻，见图1。

2.3 各组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度评分比较

模型M1组大鼠肺泡炎及纤维化程度评分较对照C1组、治疗T1组均显著升高(P<0.05)；模型M2组大鼠肺泡炎及纤维化程度评分较对照C2组升高，而治疗T2组较M2组下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.4 各组大鼠肺组织MMP-2、TIMP-1及MMP-2/TIMP-1比较

M1组大鼠MMP-2/TIMP-1比值较对照C1组、治疗T1组均显著升高(P<0.05)；M2组大鼠肺泡炎及纤维化程度评分较对照C2组升高，而治疗T2组较M2组下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。各组大鼠肺组织MMP-2/TIMP-1分别与肺泡炎程度评分、肺纤维化程度评分存在显著正相关(r分别为0.63、0.57)。

图1 大鼠肺组织病理学观察(左图为HE×100倍，右图为Masson×100倍)

治疗时间(d)组别肺泡炎程度(分)肺泡炎程度(分)MMP-2(分)TIMP-1(分)MMP-2/TIMP-128C10.00±0.000.00±0.000.04±0.010.19±0.040.20±0.11M12.60±0.55a3.00±0.00a0.25±0.01a0.06±0.00a4.23±0.51aT12.17±0.752.17±0.750.17±0.020.08±0.012.20±0.5642C20.00±0.000.00±0.000.05±0.020.16±0.020.30±0.12M22.40±0.55b3.00±0.00b0.23±0.02b0.05±0.004.51±0.37bT21.80±0.84c3.00±0.00c0.18±0.02c0.07±0.012.72±0.61c

注：M1组与C1、T1组比较，aP<0.05；M2组与C2组比较，bP<0.05；M2组与T2组比较，cP<0.05。

3 讨论

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是间质性肺疾病的终末期病变，由多种原因引起，以肺泡间质慢性炎症、成纤维细胞异常增殖及大量细胞外基质聚集为特征[1]。近年研究发现，基质金属蛋白酶家族(MMPs)参与了肺纤维化的发病过程。MMPs是一类高度保守的锌离子依赖内肽酶，能够降解细胞基膜成分及细胞外基质(ECM)，其中MMP-2是降解ECM、肺间质IV型胶原的主要酶类。有学者观察到肺纤维化早期病理是以肺泡炎症改变为主，后期逐渐发生肺纤维化，同时肺组织的TIMP-1表达升高，MMP-2/9活性下降[2]。目前，已证实MMP-2及其抑制剂TIMP-1的表达失衡在肺纤维化的发病过程起关键作用[3]。调节MMP-2/TIMP-1的表达失衡有望阻断或延缓肺纤维化的发生。

间充质干细胞(MSCs)作为存在于骨髓、脐血等部位的多能干细胞，具有多向分化潜能，可修复组织损伤，对包括IFN-γ、TGF-β1、MMP-2及TIMP-1等因子起免疫调节作用。如吴志勇等[4]发现骨髓MSCs可改变心衰大鼠的心肌细胞核的NF-kB基因表达，升高MMPs及降低TIMPs水平。本实验选择脐血间充质干细胞(CB-MSCs)对博来霉素诱导的肺纤维大鼠进行干预，观察到P组大鼠MMP-2/TIMP-1比值较正常组对照C组大鼠明显升高，并随时间进展；而在给予脐血间充质干细胞治疗的大鼠比较模型组有显著性降低 (第28 d、42 d分别为2.20±0.56vs4.23±0.51，2.72±0.61vs4.51±0.37)。由于肺纤维化形成过程中，包括TGF-β1等促炎因子激活，导致肺上皮间质转化(EMT)和促进胶原纤维在肺内沉积等发生[5]，成纤维细胞在受到TGF-β1刺激后，可引起MMP-2等MMPs的基因和蛋白表达上调[6]。本实验证实了脐血MSCs能够有效改善MMP-2/TIMP-1水平失衡。

实验中观察到PF模型组大鼠肺泡间隔明显增宽，伴水肿、出血，大量炎性细胞浸润；Masson染色可见肺泡结构紊乱，大量蓝绿染色的胶原纤维沉积，并随时间加重。脐血MSCs治疗后肺泡炎程度则显著减轻，HE、Masson染色均可见肺纤维化、肺泡间隔增宽、胶原沉积程度显著减轻。比较各组大鼠发现PF大鼠肺组织肺泡炎及纤维化程度评分较正常组明显升高，CB-MSCs治疗组大鼠较模型组有显著下降。肺组织MMP-2/TIMP-1分别与肺泡炎程度评分、肺纤维化程度评分呈显著正相关。本实验证实了脐血MSCs能够有效延缓肺纤维化进展，其机制与调节MMP-2/TIMP-1水平密切相关。

MMPs家族可通过多种途径参与到肺纤维化的进程。TIMP-1是MMP-2的内源性抑制剂，可通过酶的催化结构域，与MMP-2以1∶1的形式紧密结合，形成复合体，抑制MMP-2的活性，从而减轻MMP-2对细胞外基质的降解作用[7]。但矛盾的是，本研究发现脐血间充质干细胞并不是通过提高MMP-2水平而改善肺纤维化进展，相反，在MMP-2，MMP-2/TIMP-1水平下调后，MSCs治疗组大鼠的肺泡炎症、纤维化程度反而得到显著改善。由于博来霉素诱导PF的早期阶段，肺组织MMP-2活性增高，其后的纤维化形成过程中TIMP-1的基因表达明显升高，导致MMPs/TIMPs比例失衡，促使MMPs溶解细胞外基质能力下降，引起胶原纤维沉积。由于肺纤维化发病过程中的MMP/TIMP连续性动态变化仍不清晰，可能导致各实验间相悖结果出现，仍需进一步探讨。

综上可见，本研究证实了脐血间充质干细胞移植可延缓肺纤维化进展，改善MMP/TIMP失衡是MSCs延缓PF的重要机制。但肺纤维化发病过程中的MMPs/TIMPs连续性动态变化、临床上应用脐血MSCs治疗肺纤维化效果仍有待更深入的研究以阐明。

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