磷酸腺苷活性激酶/环氧化酶-2在槲皮素抑制K562白血病细胞增殖中的作用

牛国敏，张复华，杨国雷，凌奕文，潘焕玉，于嗣俭，徐嘉愉，麦秀渠

(南方医科大学附属南海医院血液科，广东 佛山 528200)

槲皮素(Quercetin)是自然界中分布最广泛的植物黄酮类化合物，具有抗氧化、抗过敏、抗血栓、抗血小板聚集和神经保护等作用[1]。近年来发现槲皮素对包括白血病在内的多种恶性肿瘤细胞有生长抑制作用，是有希望的新型天然低毒抗肿瘤药物。研究表明槲皮素可以通过激活磷酸腺苷活性激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/环氧化酶-2(Cyclooxygense-2，Cox-2)途径抑制胰腺癌、乳腺癌、及急性白血病细胞增殖[2]，在慢性粒细胞白血病细胞株K562是否有类似的作用仍是未知。本实验拟通过研究槲皮素对K562细胞增殖的影响明确槲皮素抗慢性粒细胞白血病能力，并初步探讨AMPK/Cox-2途径在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

槲皮素(来自Sigma Chemical Company USA)；兔抗人p-AMPK IgG单克隆抗体(来自Cell Signaling Technology USA)；鼠抗人Cox-2 IgG单克隆抗体(来自Cayman Chemical Company USA)；兔抗人β-actin IgG单克隆抗体(来自Cell Signaling Technology USA)。

1.2 细胞培养

K562细胞购于中国医学科学院天津血液病研究所。K562细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清、3%谷氨酰胺的RPMI1640完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每2～3 d传代换液一次，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3 CCK-8 法检测细胞毒性作用

收集对数生长期的细胞 根据预实验结果，槲皮素终浓度设为0 μm、50 μm、100 μm、150 μm，与K562细胞共同孵育48 h后加入37 ℃预热的CCK-8，在培养箱中继续孵育4 h后在酶标仪上检测，以空白组调零，检测波长为450 nm，参照波长为630 nm，测定各孔吸光度值，记录结果，取三个复孔的平均吸光度值作为该浓度条件下的OD值。试验重复3次，取平均值。细胞存活率(%)=(处理组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 Western-blot方法检测细胞中p-AMPK、Cox-2、β-actin蛋白的表达

K562细胞分别用0 μm、50 μm、100 μm、150 μm浓度槲皮素处理48 h，用磷酸盐缓冲剂(PBS)洗3次，超声裂解细胞并离心，取上清蛋白液定量后加入5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样缓冲液，转膜封闭洗膜后结合一抗：二抗后行发光鉴定，跑胶后用凝胶分析软件对图像进行分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 CCK-8法检测槲皮素对K562细胞的毒性作用

槲皮素与K562细胞共同孵育48h后检测细胞存活率。当槲皮素作用浓度分别为50 μm、100 μm和150 μm时，细胞存活率分别为(70.13±1.34)%，(34.61±1.55)%和(13.29±2.58)%。与对照组(100±2.17)%比较均有统计学意义(P<0.05)。槲皮素孵育48h的细胞半数抑制浓度(inhibitory concentraumtion，IC50)值为83.11 μm。

2.2 槲皮素对K562细胞p-AMPK蛋白表达的影响

K562细胞分别与0 μm、50 μm、100 μm、150 μm浓度槲皮素共同孵育48h提取细胞，用Western-blot法检测蛋白表达水平。结果显示：经槲皮素孵育后p-AMPK蛋白表达水平上升，槲皮素作用浓度愈高，p-AMP上升越明显。当槲皮素作用浓度为50 μm时，p-AMPK的表达水平是对照组的1.25倍(P<0.05)；作用浓度为100 μm时， p-AMPK的表达是对照组的1.54倍(P<0.05)；作用浓度为150 μm时， p-AMPK的表达是对照组的1.62倍(P<0.05)，见图1。

图1 槲皮素影响p-AMPK蛋白水平的表达

2.3 槲皮素对K562细胞p-AMPK

K562细胞分别与0 μm、50 μm、100 μm、150 μm浓度槲皮素共同孵育48 h提取细胞后检测Cox-2蛋白表达水平。结果显示：经槲皮素孵育后Cox-2蛋白表达水平明显下降，槲皮素作用浓度愈高，Cox-2下降越明显。当槲皮素作用浓度为50 μm时，Cox-2较对照组下降33.3%；(P<0.05)；作用浓度为100 μm时，Cox-2较对照组下降60.7%(P<0.05)；作用浓度为150 μm时，Cox-2较对照组下降70.4%(P<0.05)，见图2。

图2 槲皮素影响Cox-2蛋白水平的表达

3 讨论

目前抗肿瘤药物的研究重点已经由细胞毒药物转向寻找针对新靶点，提高选择性，增加安全性和克服耐药性的新型药物。植物来源的药物以其作用机制广泛和低毒性成为目前的研究热点。槲皮素是自然界中分布最广泛的植物黄酮类化合物，以糖苷的形式广泛存在于植物的花、叶和果实中。研究证明槲皮素包括急性白血病在内的多种肿瘤均有抑制作用。本课题组前期研究发现槲皮素通过诱导凋亡的方式抑制急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞的增殖[3]。本实验结果也显示槲皮素亦可以抑制慢性粒细胞白血病细胞K562的增殖，其抑制程度具有浓度依赖性。相较于HL-60细胞，槲皮素作用于K562的IC50值更高，提示HL-60细胞对槲皮素更加敏感，但考虑到槲皮素的低毒性，槲皮素仍可有效抑制K562的增殖。

AMPK可以通过感受AMP/ATP比率变化而调节能量代谢，在细胞能量调节中处于中枢地位。在恶性肿瘤发生发展过程中，能量调节能力失衡是其中的关键因素之一，因此AMPK是新的肿瘤预防及治疗的新靶点。近年来关于围绕着肿瘤发生发展过程中AMPK上下游信号转导通路的研究日益增多[4]，包括AMPK激活剂的研发也有进步[5]。本课题组针对槲皮素抑制HL-60细胞增殖的作用机制做了深入的研究，发现槲皮素是有效的AMPK激活剂，槲皮素通过激活AMPK抑制Cox-2的表达进而抑制HL-60细胞增殖[6]。Cox-2是前列腺素合成过程中的重要限速酶，能促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤细胞侵袭的能力，Cox-2抑制剂可用于癌症的辅助治疗[7]。Lee等[8]亦发现槲皮素通过AMPK/Cox-2通路抑制乳腺癌细胞系MCF和HT-29结肠癌细胞系。慢性粒细胞白血病相对于急性白血病，疾病自然病程长，可能发生的肿瘤代谢紊乱亦会增加，推测槲皮素作为植物类低毒性药物在慢粒白血病的治疗有可能一定的优势。本实验针对K562细胞株亦得到了与HL-60细胞株相似的结果，随着槲皮素浓度的升高，K562细胞存活率逐渐下降，p-AMPK表达上调，Cox-2表达下降，提示槲皮素通过AMPK/Cox-2途径抑制K562细胞增殖。

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