茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞侵袭力的影响

严正强 陈铁定 陈力 张琴 杨远清

●论 著

茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞侵袭力的影响

严正强 陈铁定 陈力 张琴 杨远清

目的 探讨茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞侵袭力的影响。方法 在人前列腺癌PC-3M细胞培养器皿中分别加入用完全培养液稀释的40、60、80μg/ml茶多酚溶液，24、48h后通过细胞侵袭实验观察PC-3M细胞的侵袭能力，采用RT-PCR和Western blot检测其MMP-2、TIMP-2 mRNA、蛋白表达水平，并与只添加完全培养液的0μg/ml组比较。结果 茶多酚处理后的PC-3M细胞侵透基质胶，迁移至胶中或胶下表面的数量减少，且呈浓度、时间依赖性。与0μg/ml组相比，40、60、80μg/ml组MMP-2 mRNA、蛋白表达水平均明显下调，TIMP-2 mRNA、蛋白表达水平均明显上调；茶多酚可在mRNA、蛋白水平下调MMP-2、上调TIMP-2基因转录，大致呈浓度、时间依赖性（均P＜0.05）。结论 茶多酚可在体外减弱人前列腺癌PC-3M细胞的侵袭力，可能与下调MMP-2、上调TIMP-2基因的转录与表达有关。

茶多酚 前列腺癌 肿瘤侵袭 基质金属蛋白酶-2 金属蛋白酶组织抑制因子-2

浸润转移是指肿瘤细胞通过一系列生化反应脱离原发灶转移到其他器官组织继续恶性增殖，形成与原发灶性质相同的继发肿瘤的过程。它是恶性肿瘤的典型特征，是促使肿瘤患者最终衰竭死亡的根本原因。肿瘤细胞的浸润转移是多阶段的精细复杂的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的相互作用，受多种基因的调控。本文就茶多酚是否可以减弱人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M的浸润转移能力作一探索。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 茶多酚（98%）购自广州市齐云生物技术有限公司，胎牛血清购自依科赛（上海）生物制品有限公司，IMDM培养基购自美国GIBCO公司，Transwell板（12上室/24孔板，8.0μm）购自美国的Corning公司。基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，MMP-2抗体、TIMP-2抗体、β-Actin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。RT-PCR使用美国GeneAmp公司的PCR扩增仪9700型，蛋白电泳使用美国Bio-rad公司的蛋白质电泳装置、电转移系统，数据拍照记录使用上海Tanon凝胶成像系统2500R。

1.2 细胞系及培养条件 人前列腺癌PC-3M细胞株由吉林大学前列腺防治研究中心馈赠，培养在含10%胎牛血清的IMDM培养液中，置37℃、5%CO2湿化的培养箱中；待细胞融合70%～80%培养孔时，分组（24、48h）加药，4孔/组；将培养液更换为完全培养液稀释的茶多酚溶液，其终浓度为0、40、60、80μg/ml。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞侵袭实验 用完全培养液稀释的终浓度为0、40、60、80μg/ml的的茶多酚溶液作用24、48h，收集2个时点的PC－3M细胞并配成细胞悬液（2.0×105/ml）。分别加入已预铺Matrigel的Transwell上室，100μl/上室。下室加入500μl含有20%FBS条件培养基，37℃、5% CO2、湿化培养箱中孵育。24h后取出上室，用棉球擦去上室内聚酯膜表面的细胞。用0.1%结晶紫染色后，显微镜下取3～5个视野观察上室聚酯膜下表面的细胞，拍照、计数。

1.3.2 RT－PCR检测MMP－2、TIMP－2 mRNA表达水平加药处理24、48h后，提取细胞总RNA。应用半定量RT－PCR扩增目的基因MMP－2、TIMP－2和内参基因GAPDH，引物序列见表1。使用GIS凝胶分析软件进行光密度扫描分析，MMP－2、TIMP－2 mRNA表达水平以MMP－2、TIMP－2产物与内参GAPDH产物的光密度比值表示。

表1 MMP-2、TIMP-2与GAPDH的引物

1.3.3 Western blot检测MMP－2、TIMP－2蛋白表达水平 加药处理24、48h后收集、提取细胞总蛋白并应用Bio－rad法进行定量；取30μg蛋白进行12%聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS－PAGE），电泳结束后转移蛋白至聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，用5%脱脂奶粉、4℃封闭过夜，含0.05%Tween20的TBS缓冲液（TBST）洗膜3次；室温加入1∶400兔抗人MMP－2、TIMP－2抗体，孵育2h，TBST洗膜3次；加入1∶2 000稀释的羊抗兔IgG/AP，室温孵育2h，TBST洗膜3次；5－溴－4－氯－3－吲哚基－磷酸盐/四唑硝基蓝溶液（BCIP/NBT）显色。运用GIS凝胶分析软件进行光密度扫描分析，MMP－2、TIMP－2蛋白表达水平以MMP－2、TIMP－2蛋白与内参β－actin蛋白的电泳条带亮度比值表示。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。上述实验方法重复3次，计量资料用表示，2个时点比较采用独立样本t检验；各剂量组间比较采用多因素方差分析，两两比较采用Dunnett－t检验。

2 结果

2.1 细胞侵袭实验 经茶多酚处理后，PC－3M细胞侵透基质胶，迁移至胶中或胶下表面的数量减少，且大致呈浓度、时间依赖性，见图1－2和表2。

2.2 MMP－2、TIMP－2 mRNA表达水平 与0μg/ml组相比，40、60、80μg/ml组MMP－2 mRNA表达明显下调，TIMP－2 mRNA表达明显上调，见图3和表3。茶多酚可在mRNA水平下调MMP－2、上调TIMP－2基因转录，且大致呈浓度、时间依赖性（均P＜0.05），见图4－5。

2.3 MMP－2、TIMP－2蛋白表达水平 与0μg/ml组相比，40、60、80μg/ml组 MMP－2蛋白表达明显下调，TIMP－2蛋白表达明显上调，见图6和表4。茶多酚可在蛋白水平下调MMP－2、上调TIMP－2表达，且呈浓度依赖性（P＜0.05）；2个时点间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图7－8。

3 讨论

MMPs因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，在1962年被Jerome Gross、Charles Lapiere在研究蝌蚪向蛙演变过程中的尾巴退行性变时发现[1]。MMPs可降解细胞外基质的各种蛋白成分，破坏保护机体的组织屏障，在肿瘤侵袭转移中起着无可替代的作用，因而被认为是肿瘤侵袭过程中主要的蛋白水解酶。MMPs是一个大家族，按作用底物不同及片断同源性，可将MMPs分为以下五类[2－4]：胶原酶、明胶酶、基质溶解素、膜型基质金属蛋白酶、其他。其中明胶酶（Ⅳ型胶原酶）在肿瘤细胞的侵袭转移过程中的作用尤为重要，主要有两种形式：一种非糖化，分子量为72kDa，称为明胶酶A；另一种被糖化，分子量为92kDa，称为明胶酶B。在肿瘤细胞侵袭过程中，活化的MMP－2定位于细胞膜上突起的侵入足部位发挥作用，考虑在酶解基底膜及细胞间基质成分中起着“钻头”的作用[5]。

图1 细胞侵袭实验结果（结晶紫染色，×200）

表2 各组细胞侵袭实验后的细胞计数比较（个）

图2 细胞侵袭实验的效应图（a：浓度效应；b：时间效应）

图3 MMP-2、TIMP-2 mRNA表达的电泳图

TIMPs是MMPs的特异性抑制剂，它以共价键的形式与MMPs相结合成1∶1复合体，可通过自身水平的变化特异性来调节体内的MMPs活性。TIMP-2是MMP-2的特异性抑制剂，通过MMP-14来实现对MMP-2的调节[6]：TIMP-2首先与活化的MMP-14的N端结合，随之以TIMP-2的C端结合ProMMP-2的C端区域，从而形成MMP-14-TIMP-2-ProMMP-2复合物；然后在另一游离MMP-14的作用下，ProMMP-2裂解成有活性的MMP-2。由此，体内TIMP-2水平较高时，游离MMP-14相对较少，从而抑制MMP-2的激活；当体内TIMP-2水平较低时，则介导MMP-2的激活[7]。此外，TIMP-2对金属蛋白酶家族其他酶类亦有一定的抑制作用，通过阻断被激活的MMP的水解活性，从而抑制癌细胞侵袭转移[8]。

表3 各组MMP-2、TIMP-2 mRNA表达水平比较

图4 MMP-2、TIMP-2 mRNA表达水平的浓度效应（a：MMP-2；b：TIMP-2）

图5 MMP-2、TIMP-2 mRNA表达水平的时间效应（a：MMP-2；b：TIMP-2）

图6 MMP-2、TIMP-2蛋白表达的电泳图

表4 各组MMP-2、TIMP-2蛋白表达水平比较

图7 MMP-2、TIMP-2蛋白表达水平的浓度效应（a：MMP-2；b：TIMP-2）

图8 MMP-2、TIMP-2蛋白表达水平的时间效应（a：MMP-2；b：TIMP-2）

Kanoh等[9]关于前列腺癌患者血清MMP-2表达水平的研究发现，MMP-2与肿瘤的侵袭与转移呈正相关，对临床中判断前列腺癌病情进展具有指导意义。Verheijen等[10]比较正常前列腺组织与前列腺癌组织发现，正常或早期的前列腺癌MMP-2/TIMP-2的比值接近1.0，而重度、晚期的肿瘤达到3.3、2.8。Stearns等[11]研究表明MMP-2在前列腺癌组织中表达增高，且与Gleason评分呈正相关。Kawamata等[12]将TIMP-2 cDNA转染入小鼠膀胱癌细胞系LMC19，再原位移植入裸鼠体内，结果发现表达TIMP-2较多的肿瘤细胞发生癌栓血管外生长的能力随之下降；此外，还发现将TIMP-2静脉输入转染了ras基因的裸鼠体内，可抑制鼠NIK3T3细胞所引起的肺转移瘤。Demeule等[13]研究证明，儿茶素类成分EGCG通过抑制明胶酶对人前列腺癌细胞株DU-145、LNCaP的增殖和转移均有抑制作用。笔者前期实验也证实了茶多酚对人前列腺癌细胞株PC-3M具有抑制增殖、促进凋亡的作用[14-15]。本研究通过细胞侵袭实验观察PC-3M细胞的侵袭能力，笔者选用了Transwell，预先在每个小室内铺上Matrigel（主要成分为层黏连蛋白、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白），模拟机体基底膜的屏障作用。Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，与天然基底膜结构极为相似。具有高侵袭性能的肿瘤细胞在趋化因子的诱导下，通过黏附、降解、变形运动而穿过基底膜胶，能有效在体外模拟肿瘤细胞侵袭过程[16]。本实验发现，0μg/ml组PC-3M细胞具有较强的侵袭能力，茶多酚处理后PC-3M细胞侵蚀Matrigel的能力明显降低，且呈时间、浓度依赖性。RT-PCR、Western blot结果表明40、60、80μg/ml组较0μg/ml组的MMP-2基因转录与翻译明显减弱，而TIMP-2基因转录与翻译明显增强。因此，笔者认为茶多酚能下调MMP-2表达、上调TIMP-2表达，并且减弱肿瘤细胞PC-3M的侵袭能力；但RT-PCR、Western blot结果在时间依赖性上并不完全一致，考虑MMP-2与TIMP-2基因在转录后还受到其他因素的进一步调控。

综上所述，茶多酚可在体外减弱人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞的侵袭力，且在一定范围内具有时间、浓度依赖性；可能与下调MMP-2、上调TIMP-2基因的转录与表达有关。前列腺癌发病率的东西方差异可能主要体现在进展期前列腺癌阶段；因此，这为解释前列腺癌发病率的东西方差异、验证茶多酚对前列腺癌的治疗与预防价值提供了实验依据。

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Effect of tea polyphenols on invasive ability of prostate cancer PC-3M cells

YAN Zhengqiang,CHEN Tieding,CHEN Li,et al. Department of Urology，Eastern Hospital of Ningbo Medical Center,Ningbo 315103，China

Tea polyphenolProstate cancerNeoplasm invasiveness MMP-2 TIMP-2

2016-12-28）

（本文编辑：陈丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2016-2210

315103 宁波市医疗中心李惠利东部医院泌尿外科

严正强，E-mail：mqyz@tom.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of tea polyphenols(TPs)on invasive ability of human prostate cancer PC-3M cells. Methods Human prostate cancer PC-3M cells were treated with 40,60,80μg/ml tea polyphenol for 24h or 48h in vitro.The invasive ability of PC-3M cells was determined by Transwell assay,and the expression of MMP-2,TIMP-2 mRNA and protein was detected by RT-PCR and Western blot,respectively. Results Transwell assay showed that the invasive ability of PC-3M cells was decreased after treatment with tea polyphenol.The expression of MMP-2 mRNA and protein in PC-3M cells was increased after treated with 60μg/ml and 80μg/ml for 24h or 48h were significantly decreased(P＜0.05),while the expression of TIMP-2 mRNA and protein was increased(P＜0.05)in a dose-dependent and time-dependent manner(P＜0.05). Conclusion Tea polyphenols can reduce the invasive ability of human prostate cancer PC-3M cells in vitro,which may be related to the down-regulation of MMP-2 and up-regulation of TIMP-2 gene expression.