骨肉瘤中Axl抑制凋亡及与凋亡蛋白的相关性

蒋 念，王雪迪，田 锐，谢显彪，赖英荣，彭挺生

骨肉瘤中Axl抑制凋亡及与凋亡蛋白的相关性

蒋 念1，王雪迪1，田 锐1，谢显彪2，赖英荣1，彭挺生1

目的 探讨受体酪氨酸激酶Axl在骨肉瘤中的抗凋亡作用，分析磷酸化Axl(P-Axl)与抗凋亡蛋白之间的相关性。方法 常规培养骨肉瘤细胞株MG63、143B和U2OS，分别设立人重组蛋白Gas6刺激组、Axl siRNA转染组、Gas6刺激+Axl siRNA转染组及各阴性对照组，应用顺铂(DDP)或氨甲喋呤(MTX)致使细胞凋亡后，通过Hoechst 33258染色、MTT实验、Annexin V-FIFC等检测法统计分析不同处理组间细胞凋亡率的差异及不同浓度Gas6刺激后骨肉瘤细胞的细胞周期变化；采用免疫组化EnVision两步法检测41例骨肉瘤及18例骨纤维结构不良组织中P-Axl、BCL-2及Bax的表达，分析患者预后与三者的相关性；应用TUNEL染色分析骨肉瘤组织中P-Axl表达水平与细胞凋亡率的相关性。结果 Hoechst 33258、MTT、Annexin V-FIFC等的实验结果一致，均表明骨肉瘤细胞株MG63、143B和U2OS中Gas6通过活化Axl降低DDP或MTX导致的细胞凋亡率(P<0.05)，Axl siRNA则引起细胞凋亡率增加(P<0.05)，在Axl siRNA干扰前Gas6预刺激有降低凋亡率的趋势。41例骨肉瘤组织中P-Axl、BCL-2、Bax的阳性率分别为85.4%、70.7%及36.6%；18例骨纤维结构不良组织中三者阳性率分别为11.1%、22.2%及11.1%，两组相比骨肉瘤组织中P-Axl、BCL-2、Bax的表达明显增高(P<0.05)。Pearson相关性分析显示BCL-2表达与P-Axl呈显著正相关(r=0.842，P<0.000 1)；Cox单因素风险回归分析发现BCL-2和Bax表达是影响患者预后的预测因素；TUNEL结果显示P-Axl高表达的骨肉瘤组织中细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。结论 骨肉瘤中Gas6/Axl活化后通过调节凋亡蛋白BCL-2，抑制由DDP或MTX诱发的细胞凋亡，从而促进肿瘤的进展。

骨肉瘤；Axl；BCL-2；细胞凋亡；预后

骨肉瘤是原发于骨的恶性肿瘤，好发于儿童和青少年，其恶性度高，易发生早期肺转移。目前采用新辅助化疗和外科手术相结合的标准治疗方式，但由于缺乏早期诊断指标和肿瘤化疗耐受等因素，患者的预后情况较差[1]。Axl是TAM酪氨酸激酶受体家族中的一员，其家族成员中还包括Tyro3等[2-3]。TAM酪氨酸激酶受体家族有2个共同的配体Gas6和protein S，其中Gas6/Axl蛋白复合物参与调控体内肿瘤多种生物学行为，如细胞增殖、凋亡、迁移、黏附等[4]。细胞凋亡即细胞程序性死亡，与体内多种疾病的发生发展相关[5]。BCL-2家族属于凋亡相关蛋白，包括促凋亡因子(Bax、Bak、Bad等)和抗凋亡因子(BCL-2、BCL-xL、BCL-w等)。细胞接收凋亡信号后，线粒体膜渗透性增高，释放细胞色素C，抗凋亡蛋白可通过抑制细胞色素C的释放抑制凋亡，其促凋亡蛋白作用与之相反[6]。BCL-2在多种肿瘤如乳腺癌、前列腺癌中表达增高[7-8]，在非小细胞肺癌中BCL-2高表达者预后差[9]；Bax在结肠癌、鼻咽癌中的表达降低[10-11]，在口腔鳞癌中Bax高表达者预后较好[12]。因此，凋亡相关蛋白在不同肿瘤中的表达水平不尽相同，可能与肿瘤的预后有关。本文着重探讨骨肉瘤中凋亡相关蛋白BCL-2和Bax的表达，分析磷酸化Axl(P-Axl)与BCL-2、Bax表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2010～2013年中山大学附属第一医院首诊无转移的41例骨肉瘤石蜡标本，其中男性23例，女性18例；患者年龄8～58岁，平均16.32岁；术后随访30～70个月，16例患者死于骨肉瘤。另收集18例骨纤维结构不良石蜡标本作为良性对照组。

1.2 试剂 收集骨肉瘤细胞株MG63、143B、U2OS(中科院上海细胞研究所)，DMEM培养基、胎牛血清、100 U/mL青链霉素双抗(GIBCO)，P-Axl单克隆抗体和人重组蛋白Gas6(R&D，美国)，BCL-2、Bax单抗(DAKO，丹麦)，顺铂(DDP)、氨甲喋呤(MTX)(大连美仑公司)，Axl siRNA及阴性对照siRNA、RNA提取试剂盒(广州锐博公司)，X-treme(Roche，美国)，qRT-PCR逆转录试剂盒、扩增试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒及引物(Japan Takara)，Hoechst 33258、MTT、DNA检测试剂盒、免疫组化二抗试剂盒(凯基，中国)，Annexin-V-FITC、TUNEL试剂盒(Roche，德国)，荧光显微镜(Leica，德国)，流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)。

1.3 Axl siRNA瞬时转染骨肉瘤细胞系 收集对数生长期的细胞株MG63、143B，提前1天接种于6孔板，密度为30%，当细胞生长密度增至60%，换无血清培养液，每孔1.5 mL，4 h后实验组每孔加入Axl siRNA 5 μL、opti-mem 500 μL和x-treme 5 μL混合物，对照组加入对照siRNA 5 μL、opti-mem 500 μL和x-treme 5 μL混合物(室温下已静置30 min)，轻摇后置于37 ℃培养箱中6 h，换完全培养液，48 h内提取RNA并逆转录成cDNA，采用荧光定量PCR进行扩增。Axl引物正向： 5′-TCAAGGTGGCTGTGAAGACGA-3′，反向：5′-CGTTCAGAACCCTGGAAACAGAC-3′；GAPDH引物正向：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAA C-3′，反向：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.4 Hoechst 33258染色检测凋亡细胞 骨肉瘤细胞株MG63和U2OS分别用浓度为0、400 ng/mL的Gas6预处理24 h，然后用20 μL/mL DDP或600 μL/mL MTX处理24 h。1 μL/mL Hoechst 33258避光室温染色10 min，荧光显微镜下拍照；实验重复3次。用1-OD(处理组)/OD(对照组)计算抑制率，细胞抑制率高者凋亡细胞百分率(凋亡率)低，细胞抑制率低者细胞凋亡率高。

1.5 MTT法检测细胞凋亡率 取对数生长期的细胞株MG63和143B，以每孔3×103个接种于96孔板。分别设阴性对照组、Gas6刺激组、Axl siRNA转染组和Axl siRNA转染+Gas6刺激组，以此为基础再分别设置DDP或MTX处理组。细胞接种后孵育过夜，无血清培养4 h转染Axl siRNA。转染6 h后继续无血清培养，然后分别在Gas6刺激组和Axl siRNA转染+Gas6刺激组加入浓度为200 ng/mL Gas6培养24 h；化疗组中DDP的终浓度为20 μg/mL，MTX的终浓度为300 μg/mL，孵育24 h。最终用MTT法检测不同实验组细胞的凋亡率。

1.6 Annexin V-FIFC双染检测细胞凋亡率 取对数生长期细胞株MG63，以每孔2×105个接种于6孔板中。实验分组设置与MTT实验相同。分别用Axl siRNA、Gas6或DDP、MTX处理后，按Annexin V-FITC试剂盒说明书，加入100 μL混合液进行染色，室温放置15 min后转入流式硬管中，每管再加入200 μL Buffer，用流式细胞仪以488 nm为激发波长检测分析各实验组细胞的凋亡率；各实验重复3次。1.7 细胞周期检测 取对数生长期细胞株MG63、U2OS，应用浓度分别为0、100、200、400 ng/mL的Gas6处理48 h。PI染色后，应用流式细胞仪以488 nm为激发波长分析各实验组的细胞周期；各实验重复3次。1.8 免疫组化及判断标准 采用免疫组化EnVision两步法检测P-Axl、BCL-2、Bax蛋白表达，选取三位病理医师采用盲法阅片。按细胞阳性百分比判断：无阳性细胞为0分，<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。按细胞阳性强度判断：0分为阴性，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳性。两者相乘以P-Axl评分≥2分为高表达，<2分为低表达；BCL-2和Bax评分≥2分为阳性，<2分为阴性。

1.9 TUNEL染色检测骨肉瘤组织中凋亡细胞 随机选取10例Axl高表达组与10例Axl低表达组，石蜡切片脱蜡、水化，置入含0.1% TritonX-100的10 mmol/L枸橼酸盐(pH 6.0)水浴30 min以透膜，1 μg/mL的蛋白酶K 37 ℃消化10 min。每张切片滴加50 μL TUNEL反应混合液，置于37 ℃湿盒避光反应1 h，PBS漂洗3次，荧光显微镜下计数凋亡细胞[激发波长为450～500 nm，检测波长为515～565 nm(绿色)]；计算每张切片的平均阳性率。

1.10 统计学分析 应用两独立样本t检验和χ2检验进行统计学分析；采用Pearson相关性分析P-Axl、BCL-2和Bax蛋白表达的相关性；应用Cox单因素风险回归分析骨肉瘤患者预后的危险因素。所有数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gas6/Axl增强骨肉瘤细胞对DDP和MTX的抗凋亡作用 Hoechst 33258染色发现，MG63在DDP或MTX处理后，化疗药所致的细胞凋亡率分别为42.6%和21.9%；Gas6预刺激后，相同浓度的DDP或MTX处理的细胞凋亡率分别降为29.8%和6.4%(P<0.01)。同样，Gas6预刺激后DDP和MTX对U2OS的细胞凋亡率分别由40.0%和28.6%降为22.8%和16.4%(P<0.05)(图1A)。MTT实验发现在MG63和143B中，无论是对照组还是DDP或MTX处理组，均显示转染Axl siRNA导致细胞增殖率降低；而Gas6刺激后细胞增殖率明显增高(P<0.05)；Gas6预刺激后再转染Axl siRNA，其细胞增殖率与单独转染Axl siRNA者相比亦有增高的趋势(图1B、C)。Annexin V-FITC检测发现骨肉瘤细胞株MG63在DDP或MTX分别处理后，其凋亡率由11.16%分别增至16.90%或17.67%；反之，以未处理组细胞为例，Gas6刺激使细胞凋亡率由11.16%降为3.46%；转染Axl siRNA使细胞凋亡率增至30.09%；而Gas6预刺激后再转染Axl siRNA，可使细胞凋亡率又降至27.79%。在DDP或MTX处理组也可观察到类似结果，即Gas6预刺激降低细胞凋亡率，而Axl siRNA协同升高细胞凋亡率(图2)。与细胞凋亡实验结果不同的是，不同浓度Gas6(0、100、200、400 ng/mL)的预刺激并不能使MG63、143B细胞周期出现显著性变化。

图1 A.骨肉瘤细胞株MG63和U2OS经Gas6预刺激化疗药物DDP和MTX处理后细胞凋亡情况；B.MTT实验中143B的细胞凋亡率；C.MTT实验中MG63的细胞凋亡率

2.2 BCL-2、Bax和P-Axl蛋白在骨肉瘤组织中的表达及其与凋亡率的相关性 免疫组化结果显示BCL-2及Bax蛋白在骨肉瘤细胞质中表达，P-Axl在瘤细胞核质内表达(图3)；骨肉瘤组织中BCL-2、Bax及P-Axl蛋白表达量明显高于骨纤维结构不良组织。在41例骨肉瘤组织中，BCL-2阳性者29例(70.7%)，Bax阳性者15例(36.6%)，P-Axl高表达者35例(85.4%)；在18例骨纤维结构不良组织中，BCL-2、Bax阳性者和P-Axl高表达者分别为4例(22.2%)、2例(11.1%)和2例(11.1%)。因此，骨肉瘤组织中BCL-2、Bax和P-Axl的表达显著高于骨纤维结构不良组织(P<0.05，表1)。Pearson相关性分析显示：BCL-2与P-Axl蛋白表达呈显著正相关(r=0.842，P<0.000 1)，Bax与P-Axl、BCL-2的表达呈负相关，但差异无统计学意义。TUNEL实验证明骨肉瘤组织中P-Axl高表达者细胞凋亡率仅为1%；P-Axl低表达者细胞凋亡率为7%，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。

2.3 BCL-2和Bax蛋白表达与骨肉瘤临床病理特征的关系 BCL-2和Bax蛋白表达与患者的预后明显相关(P<0.05，表2)；Cox单因素风险回归分析发现BCL-2和Bax表达是影响患者预后的因素(P<0.05，表3)。

3 讨论

本课题组前期实验表明，Axl及其配体Gas6的活化可以促进骨肉瘤的发展，提示其预后差。由于P-Axl可抑制骨肉瘤细胞的凋亡[13]，因此Gas6/Axl信号与凋亡相关蛋白的相关性值得深入分析。本组应用骨肉瘤细胞系为基础，建立Axl siRNA抑制及Gas6刺激活化细胞模型，应用MTT、Annexin V-FIFC等方法，证明骨肉瘤细胞中Gas6与Axl结合并促其磷酸化后抑制化疗药物对骨肉瘤细胞的致凋亡作用。TUNEL实验亦表明骨肉瘤组织中P-Axl高表达者细胞的凋亡率降低，证明Gas6/Axl在骨肉瘤组织中也发挥抗凋亡作用。此外，免疫组化结果表明P-Axl、BCL-2和Bax蛋白在骨肉瘤组织中表达均高于骨纤维不良组织，Pearson相关性分析显示BCL-2与P-Axl蛋白表达呈显著正相关，而Cox单因素风险回归表明BCL-2或Bax蛋白表达是患者预后的独立因素，提示P-Axl可能通过调节细胞凋亡蛋白BCL-2抑制骨肉瘤细胞的凋亡，从而促进肿瘤进展。由于本组例数较少，Bax与P-Axl和BCL-2的表达不具有统计学意义，但其负相关趋势提示三者之间可能存在调节或平衡关系。

表1 BCL-2、Bax和P-Axl蛋白在骨肉瘤和骨纤维结构不良组织中的表达差异

图2 流式细胞术检测MG63细胞不同处理组的凋亡细胞数量

随着新辅助化疗在临床上的广泛使用，骨肉瘤患者的5年生存率有所提高。近年化疗耐药性已严重影响化疗药物的敏感性和有效性。有文献报道[14]Axl高表达可降低乳腺癌细胞对伊马替尼的敏感性，使用Axl抑制剂能使乳腺癌细胞恢复对伊马替尼的敏感。另外，阻断Axl受体可促进非小细胞肺癌细胞凋亡并增强化疗药物作用[15]。Sinha等[16]报道阻断Axl受体能促进慢性B淋巴细胞性白血病细胞的凋亡，并具有与酪氨酸激酶抑制剂的协同作用，与本实验结果一致。AKT通路下游有2条凋亡通路，外通路靶向结合凋亡受体，内通路由细胞线粒体异常引起。在外通路中，细胞的凋亡取决于BCL-2家族因子的平衡[17]； AKT/GSK3β/Cyclin D1/Cdk4通路是另一种以抑制细胞周期而致细胞凋亡的信号通路[18]。本实验发现Gas6可以不通过影响细胞周期而使骨肉瘤细胞系抗凋亡，表明Gas6可能通过AKT-BCL-2信号通路抑制细胞凋亡，而并非通过AKT-Cyclin D1通路实现作用。Hong等[19]报道耐药的急性髓系白血病细胞中Axl表达上调，Gas6/Axl活化可能通过促进BCL-2表达进一步产生耐药性，与本实验结果一致。

表2 BCL-2 、Bax蛋白表达与骨肉瘤临床病理特征的关系

③A③B③C④A④B图3 A．骨肉瘤中BCL⁃2蛋白的表达，EnVi⁃sion两步法；B．骨肉瘤中Bax蛋白的表达，EnVision两步法；C．骨肉瘤中P⁃Axl蛋白的表达，EnVision两步法 图4 TUNEL法检测骨肉瘤组织中P⁃Axl表达状况与细胞凋亡率的关系：A．骨肉瘤中P⁃Axl低表达；B．骨肉瘤中P⁃Axl高表达

表3 Cox单因素回归分析预后相关因素

综上所述，本实验结果提示骨肉瘤中Gas6/Axl活化后通过调节凋亡蛋白BCL-2，促进骨肉瘤细胞抵抗由DDP或者MTX诱发的细胞凋亡，从而促进肿瘤的进展。因此，未来抑制Axl表达或活化可能成为增加化疗药疗效、抑制肿瘤进展的治疗手段之一。

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Relationship between receptor tyrosine kinase Axl andapoptosis relative proteins in osteosarcoma

JIANG Nian1, WANG Xue-di1, TIAN Rui1, XIE Xian-biao2, LAI Ying-rong1, PENG Ting-sheng1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofMusculoskeletalOncology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Purpose To identify the role of tyrosine kinase receptor Axl for anti-apoptosis which was induced by cisplatin (DDP) and methotrexate (MTX) chemotherapy and to analyze the relationship between P-Axl and apoptosis-related proteins in osteosarcoma. Methods Osteosarcoma cell lines MG63, 143B and U2OS were used in apoptosis assays, Axl siRNA transfection, cytotoxicity assays, cell cycle analysis, etc. A total of 41 cases of osteosarcom patients were included for immunohistochemistry of EnVision two-step staining and clinico-pathological relative analysis. TUNEL assay was performed in ten cases for apoptosis detection. Results Among the osteosarcoma cell lines, Gas6/Axl could obviously protect tumor cells from apoptosis induced by DDP and MTX (P<0.05). Axl siRNA transfection enhanced cell apoptosis, whereas Gas6 prone to function upon previous knockdown by Axl siRNA. Among the 41 cases, the positive rate of P-Axl, BCL-2, and Bax was 85.4%, 70.7%, and 36.6%, respectively. In contrast, the positive rate of them was 22.2%, 11.1%, and 11.1% in osteofibrous dysplasia, respectively. The expression levels of these apoptosis-related factors were significantly higher in osteosarcoma than in osteofibrous dysplasia (P<0.05). Through clinico-pathological analysis, there were significant relationships between the survival status and BCL-2 or Bax expression (P<0.05). Pearson correlation analysis demonstrated that BCL-2 was positively correlated to P-Axl with statistical significance (r=0.842,P<0.000 1). By Cox univariate analysis, BCL-2 or Bax was correlated with the patients’ prognosis. TUNEL assay also demonstrated that P-Axl high expression inhibited apoptosis in osteosarcoma tissues. Conclusion Gas6/Axl protects osteosarcoma cells from the apoptosis induced by DDP and MTX chemotherapy and inhibits apoptosis in osteosarcoma tissue, possibly through the regulation of apoptosis-related protein BCL-2.

osteosarcoma； Axl； BCL-2； apoptosis； prognosis

国家自然科学基金(81302348)

中山大学附属第一医院1病理科、2骨肿瘤科，广州 510080

蒋 念，女，硕士研究生。E-mail: candicejang@163.com 彭挺生，女，博士，主任医师，副教授，通讯作者。E-mail：pengtsh@mail.sysu.edu.cn

时间：2017-5-17 23:52 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.005.html

R 738.3

A

1001-7399(2017)05-0490-07

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.005

接受日期：2017-04-18