乳腺癌组织中SOX4、EZH2的表达及临床意义

甘 艺，吴正升，吴 强

·论 著·

乳腺癌组织中SOX4、EZH2的表达及临床意义

甘 艺，吴正升，吴 强

目的 观察上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)调控因子SOX4和EZH2在乳腺癌组织中的表达，探讨两者的临床意义。方法 采用免疫组化EnVision两步法检测241例乳腺癌组织及126例癌旁非肿瘤乳腺组织中SOX4、EZH2的表达，分析两者表达的相关性及其与乳腺癌临床病理特征的关系。结果 乳腺癌组织中SOX4的高表达率为82.2%，显著高于癌旁非肿瘤乳腺组织的高表达率(57.1%，P<0.05)；EZH2在乳腺癌组织中的高表达率为80.1%，显著高于癌旁非肿瘤乳腺组织的高表达率(47.6%，P<0.05)。SOX4高表达与肿瘤淋巴结转移、TNM高分期、HER-2高表达相关(P<0.05)；EZH2高表达与肿瘤组织学高分级、淋巴结转移、ER阴性、EGFR阳性、Ki-67高增殖指数相关(P<0.05)，并与SOX4表达呈显著正相关(rs=0.256，P<0.001)。结论 EMT调控因子SOX4和EZH2在乳腺癌组织中表达上调，两者可能共同参与乳腺癌的转移，有望成为预测乳腺癌转移的潜在生物学标志物。

乳腺肿瘤；上皮-间质转化；SOX4；EZH2；免疫组织化学

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率呈逐年上升趋势[1]。肿瘤的转移和复发是乳腺癌患者主要致死原因[2]。因此，探索肿瘤转移的机制、改善乳腺癌患者预后成为当下研究的热点。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是早期胚胎发育过程中上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，在肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用[3]。SOX4 属于SOX家族的C亚族转录因子，能够间接诱导乳腺上皮细胞发生EMT，增强细胞的侵袭和迁移能力，从而促进乳腺癌转移，是一种新型的EMT诱导转录因子[4]。EZH2是果蝇Zeste基因增强子的人类同源物，具有组蛋白甲基转移酶活性，可通过抑制E-cadherin的表达直接诱导EMT发生，促进肿瘤转移[5]。本文采用免疫组化EnVision两步法检测乳腺癌及癌旁非肿瘤乳腺组织中SOX4与EZH2的表达，分析两者表达的相关性及其与乳腺癌临床病理特征的关系，探讨SOX4和EZH2共同调节EMT的可能，为预测乳腺癌患者转移提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料 收集安徽医科大学第一附属医院病理科2011～2014年女性乳腺浸润性癌(非特指型)石蜡包埋标本241例，年龄25～90岁，中位年龄50岁。另选取癌旁非肿瘤乳腺组织126例作为正常对照。所有病例术前均未行放、化疗等抗肿瘤治疗。由两位资深病理医师根据WHO(2012)乳腺肿瘤分类及诊断标准[6]对所有病例进行组织学分型、分级，并根据国际抗癌联盟(Union International Against Cancer, UICC)和美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)合作制定的第7版乳腺癌TNM分期系统[7-8]对所有病例进行临床分期。

1.2 试剂与方法 所有标本均以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行常规HE染色和免疫组化染色。兔抗人SOX4多克隆抗体购自Origene公司，兔抗人EZH2单克隆抗体(D2C9)购自Cell Signaling公司；即用型抗体Ki-67(MX006)购自福州迈新公司；即用型抗体ER(EP1)、PR(EP2)、HER-2(UMAB36)、EGFR(UMAB96)、免疫组化通用型EnVision两步法试剂盒及DAB显色剂，均购自北京中杉金桥公司。具体操作步骤按试剂盒说明书进行，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断 SOX4以胞质和(或)胞核出现弥漫均质的淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，EZH2以胞核出现弥漫均质的淡黄色至棕褐色颗粒为阳性，每张切片随机选取5个高倍视野观察，采用半定量评分标准[9-10]判断。(1)染色强度：无着色为0分，弱染色为1分，中等染色为2分，强染色为3分。(2)阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项结果相乘：0分为阴性组，1～4分为低表达组，分析时将阴性和低表达组合并统计；6～12分为高表达组。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。样本率之间比较采用χ2检验，相关性分析应用Spearman等级相关检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX4和EZH2在乳腺癌及癌旁非肿瘤乳腺组织中的表达 乳腺癌组织中，SOX4的表达定位于细胞质和(或)细胞核(图1)，EZH2的表达定位于细胞核(图2)。SOX4在乳腺癌组织中的高表达率为82.2%，显著高于癌旁非肿瘤乳腺组织的高表达率(57.1%，P<0.05)；EZH2在乳腺癌组织中的高表达率为80.1%，显著高于癌旁非肿瘤乳腺组织的高表达率(47.6%，P<0.05，表1)。

①A①B②A②B

图1 SOX4在乳腺癌及癌旁非肿瘤乳腺组织中的表达，EnVision两步法：A. 乳腺癌组织中高表达；B. 癌旁非肿瘤乳腺组织中低表达

图2 EZH2在乳腺癌及癌旁非肿瘤乳腺组织中的表达，EnVision两步法：A. 乳腺癌组织中高表达；B. 癌旁非肿瘤乳腺组织中低表达

2.2 SOX4和EZH2表达与乳腺癌临床病理特征的关系 乳腺癌组织中，SOX4高表达与肿瘤淋巴结转移、TNM高分期、HER-2高表达均相关(P<0.05)；与患者年龄、肿瘤直径、组织学分级、ER、PR、EGFR、Ki-67表达均无关(P>0.05)。EZH2高表达与肿瘤组织学高分级、淋巴结转移、ER阴性、EGFR阳性、Ki-67高增殖指数均相关(P<0.05)；与患者年龄、肿瘤直径、TNM分期、PR、HER-2表达均无关(P>0.05，表2)。

2.3 乳腺癌组织中SOX4、EZH2表达的相关性 乳腺癌组织中，SOX4和EZH2同时高表达168例，两者同时阴性/低表达18例。经Spearman秩相关检验，SOX4与EZH2在乳腺癌组织中的表达呈显著正相关(rs=0.256，P<0.001，表3)。

3 讨论

早期胚胎发育过程中上皮细胞通过EMT程序获得间质表型，该机制在创伤愈合、组织再生、器官炎症纤维化、恶性肿瘤进程中也发挥重要作用。发生EMT的细胞失去其原有的上皮细胞特性，如细胞极性和细胞间黏附性的降低以及上皮细胞特有标志物E-cadherin表达的下调、β-catenin表达的移位；同时出现间质细胞的特征，如细胞运动力和侵袭力的增加及间质细胞特有标志物N-cadherin、vimentin等表达上调[11]。肿瘤细胞也可通过EMT增加其侵袭性而更易向远处扩散转移。EMT的发生需要各种诱导因素的参与，如Snail、Twist、Zeb等转录因子通过直接抑制E-cadherin表达而诱导EMT发生[3]；TGF-β、Wnt、PI3K/Akt、MAPK、Src等细胞内信号通路也参与其中，而TGF-β信号通路被认为是最重要的EMT诱导信号[12]；近年来，越来越多的研究表明miRNA可以通过调节EMT相关转录因子和信号通路影响EMT程序[3]。各调控因子之间可以相互影响，共同调节EMT程序。

SOX4是一种新型转录因子，参与胚胎心脏发育、淋巴细胞成熟和胸腺发育等生理过程，可通过自身高度保守的HMG结构域与DNA结合来激活或抑制靶基因的表达[13]，也可与其他转录因子相互作用共同调节基因的表达。Zhang等[4]报道SOX4能通过间接抑制E-cadherin的表达激活乳腺上皮细胞发生EMT，进而促进乳腺癌的侵袭和转移，提示SOX4可能是一个新型的EMT诱导因子。本组实验结果显示SOX4在乳腺癌组织中的高表达率显著高于癌旁非肿瘤乳腺组织，与文献报道相符[4]。SOX4高表达与肿瘤淋巴结转移相关，提示SOX4高表达增加乳腺癌淋巴结转移的风险，可能与SOX4诱导癌细胞EMT发生有关；SOX4高表达还与TNM高分期、HER-2高表达相关，提示SOX4高表达可能与乳腺癌预后不良密切相关。

表1 SOX4和EZH2在乳腺癌及癌旁非肿瘤乳腺组织中的表达

表2 SOX4和EZH2表达与乳腺癌临床病理特征的关系

表3 乳腺癌组织中SOX4和EZH2表达的相关性

EZH2是多梳蛋白抑制复合物2(polycomb repressive complex 2, PRC2)的重要组成成分，在胚胎发育、细胞增殖及细胞周期调节中起重要作用，可催化核小体组蛋白H3的第27位赖氨酸(H3K27)发生三甲基化，甲基化后的H3K27me3可将PRC2复合物募集到特定的基因位点，进而沉默靶基因的表达[14]。Luo等[5]报道EZH2可通过H3K27me3抑制E-cadherin在喉部鳞状细胞癌中的表达，直接参与调控EMT程序，在癌症侵袭和转移过程中发挥重要作用。本组实验结果显示EZH2在乳腺癌组织中高表达率显著高于癌旁非肿瘤乳腺组织，与文献报道相符[15]。EZH2高表达与SOX4相似，均与肿瘤淋巴结转移相关，提示EZH2和SOX4在乳腺癌淋巴结转移过程中可能存在某种联系，两者可能共同参与乳腺癌EMT过程。EZH2高表达还与肿瘤组织学高分级、ER阴性、EGFR阳性、Ki-67高增殖指数等预后不良指标相关，提示EZH2高表达可能在乳腺癌分化、增殖过程中发挥重要作用。值得注意的是，本实验结果显示癌旁非肿瘤乳腺组织中SOX4和EZH2的高表达率均较高，分析原因可能有以下几方面：(1)SOX4和EZH2可参与胚胎发育、细胞成熟、分化等正常生理过程[13-14]，因此在癌旁非肿瘤乳腺组织中两者均可表达；(2)有研究表明[16]，组织学形态正常的癌旁非肿瘤组织分子状态常介于良性病变和恶性肿瘤之间，其中一些基因异常表达可预测肿瘤患者的临床预后，这或许能解释本组中癌旁非肿瘤乳腺组织SOX4和EZH2表达过高的现象，但具体机制还有待进一步探讨。

Tiwari等[17]报道SOX4可与EZH2启动子区域结合，促进EZH2表达，增加H3K27me3水平，进而诱导EMT发生。本组实验发现乳腺癌组织中SOX4与EZH2表达呈显著正相关，乳腺癌临床病理特征分析两者表达均与淋巴结转移相关，提示SOX4可能通过调节EZH2的表达促进乳腺癌组织中EMT的发生，在乳腺癌转移过程中发挥重要作用。

综上所述，乳腺癌组织中SOX4与EZH2的关系密切，两者可能共同参与EMT进程。联合检测SOX4和EZH2，有望成为预测乳腺癌转移的潜在生物学指标。

[1] Torre L A, Bray F, Siegel R L,etal. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108.

[2] Lim B, Hortobagyi G N. Current challenges of metastatic breast cancer[J]. Cancer Metastasis Rev, 2016,35(4): 495-514.

[3] Nieto M A, Huang R Y, Jackson R A, Thiery J P. EMT: 2016[J]. Cell, 2016,166(1):21-45.

[4] Zhang J, Liang Q, Lei Y,etal. SOX4 induces epithelial-mesenchymal transition and contributes to breast cancer progression[J]. Cancer Res, 2012,72(17):4597-4608.

[5] Luo H, Jiang Y, Ma S,etal. EZH2 promotes invasion and metastasis of laryngeal squamous cells carcinoma via epithelial-mesenchymal transition through H3K27me3[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016,479(2):253-259.

[6] Lakhani S R, Ellis L O, Schnitt S J,etal.WHO classification of tumours of the breast[M]. 4th ed. Lyon: IARC Press, 2012:8-38.

[7] 水若鸿，杨文涛. 乳腺癌个体化诊治相关的病理问题[J]. 临床与实验病理学杂志, 2011,27(2):113-116.

[8] Edge S B, Byrd D R, Compton C C,etal. AJCC cancer staging manual[M]. 7th ed. New York: Springer, 2010:347-376.

[9] Wang L, Zhang J, Yang X,etal. SOX4 is associated with poor prognosis in prostate cancer and promotes epithelial-mesenchymal transitioninvitro[J]. Prostate Cancer Prostatic Dis, 2013,16(4):301-307.

[10] Jin M, Yang Z, Ye W,etal. Prognostic significance of histone methyltransferase enhancer of zeste homolog 2 in patients with cervical squamous cell carcinoma[J]. Oncol Lett, 2015,10(2): 857-862.

[11] Polyak K, Weinberg R A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits[J]. Nat Rev Cancer, 2009,9(4):265-273.

[12] 姜晓玲，乔 峰，徐 维，等. 上皮-间质转化及相关信号转导通路的研究进展[J]. 临床与实验病理学杂志, 2014,30(5):547-550.

[13] Jafarnejad S M, Ardekani G S, Ghaffari M, Li G. Pleiotropic function of SRY-related HMG box transcription factor 4 in regulation of tumorigenesis[J]. Cell Mol Life Sci, 2013,70(15):2677-2696.

[14] Cao R, Wang L, Wang H,etal. Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing[J]. Science, 2002,298(5595):1039-1043.

[15] Jang S H, Lee J E, Oh M H,etal. High EZH2 protein expression is associated with poor overall survival in patients with luminal A breast cancer[J]. J Breast Cancer, 2016,19(1):53-60.

[16] Roman-Perez E, Casbas-Hernandez P, Pirone J R,etal. Gene expression in extratumoral microenvironment predicts clinical outcome in breast cancer patients[J]. Breast Cancer Res, 2012,14(2):R51.

[17] Tiwari N, Tiwari V K, Waldmeier L,etal. Sox4 is a master regulator of epithelial-mesenchymal transition by controlling Ezh2 expression and epigenetic reprogramming[J]. Cancer Cell, 2013,23(6):768-783.

Expression of SOX4 and EZH2 in breast cancer and their clinicopathologic significance

GAN Yi, WU Zheng-sheng, WU Qiang

(DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To explore the expression of two epithelial-mesenchymal transition (EMT) regulators, Sry-related high mobility group box 4 (SOX4) and enhancer of zeste homo-log 2 (EZH2), in breast cancer tissues and their clinicopatho-logic significances. Methods The expression of SOX4 and EZH2 was detected by immunohistochemistry of EnVision two-step in paraffin-embedded tissue sections from 241 cases of breast cancer and 126 cases of paracancerous breast tissues. The relationship between their expression and clinicopathologic characteristics was statistically analyzed, and their correlation was also analyzed. Results In breast cancer tissues and paracancerous breast tissues, the high expression rates of SOX4 were 82.2% and 57.1% respectively, while the high expression rates of EZH2 were 80.1% and 47.6% respectively. Their expression in breast cancer tissues was higher than that in paracancerous breast tissues (P<0.05). High SOX4 expression was correlated with lymph node metastasis, high TNM stage, and overexpression of HER-2 (P<0.05), while high EZH2 expression was correlated with high histological grade, lymph node metastasis, ER negativity, EGFR positivity and high poliferation index of Ki-67 (P<0.05). There was a positive correlation between SOX4 and EZH2 expression in breast cancer tissues (rs=0.256,P<0.001). Conclusion EMT regulators SOX4 and EZH2 might be responsible for the metastasis of breast cancer, which are upregulated in breast cancer tissues. They may act as potential biomarkers to predict the metastasis of breast cancer.

breast neoplasm; epithelial-mesenchymal transition; SOX4; EZH2; immunohistochemistry

国家自然科学基金(81372476、81472493)

安徽医科大学病理学教研室，合肥 230032

甘 艺，女，硕士研究生。E-mail: 1152257631@qq.com 吴 强，男，博士，教授，博士生导师，通讯作者。E-mail: aydjohn@yahoo.com

时间：2017-5-17 23:52 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.002.html

R 737.9

A

1001-7399(2017)05-0477-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.002

接受日期：2017-03-20