老年烧伤患者体内病理反应的变化

2017-06-23陈海燕张初苗黄琴花

中国老年学杂志 2017年11期

关键词：氧化应激引物病理

许涛陈海燕张初苗黄琴花

(复旦大学附属金山医院烧伤整形科，上海 201508)

老年烧伤患者体内病理反应的变化

许涛陈海燕1张初苗1黄琴花1

(复旦大学附属金山医院烧伤整形科，上海 201508)

目的探究老年烧伤患者体内的病理反应变化。方法选取老年烧伤患者(实验组)、健康老人(对照组)为研究对象。分别于患者烧伤后0～3 d、7～10 d和14～17 d取血浆及皮肤组织。检查血清及皮肤组织中炎症和氧化应激水平及皮肤组织中愈合相关蛋白β-catenin、转化生长因子(TGF)-β、激活蛋白(AP)-1表达情况、炎症和氧化应激相关蛋白转录因子红细胞素-2P45(NF-E2)相关因子(Nrf)2、核转录因子(NF)-κB核积累量及IκB磷酸化水平。结果与对照组相比，烧伤后0～3 d和7～10 d患者血清和皮肤组织中炎症及氧化应激水平、皮肤组织中NF-κB核积累量及IκB磷酸化水平显著升高，皮肤组织中β-catenin、TGF-β、AP-1表达及Nrf2核积累量显著下降(均P<0.05)，且这两个时间段间各病理水平无显著差异(P>0.05)；烧伤后14～17 d，患者血清和皮肤组织中炎症和氧化应激水平，皮肤组织中β-catenin、TGF-β、AP-1表达水平，Nrf2、NF-κB核积累量及IκB磷酸化水平相比于0～3 d和7～10 d患者得到显著改善(P<0.05)。结论老年烧伤患者体内的炎症和氧化应激病理反应在烧伤后0～10 d内持续处于较高水平，而在14～17 d出现恢复。

烧伤；炎症；氧化应激

烧伤不仅仅是简单的体表皮肤受损，它还会引起机体一系列的应激反应和免疫紊乱〔1，2〕。研究发现老年人群尤其容易受到烧伤的伤害〔3〕。老年烧伤多为生活烧伤，烧伤后死亡率高，愈合慢，易引发并发症，病情易被掩盖〔4，5〕。老年烧伤患者的治疗预后受到许多因素的影响。在治疗过程中感染是威胁老年烧伤患者的关键性因素〔6〕，其来源于皮肤黏膜损伤破坏使细菌在烧伤部位定植和烧伤导致的机体免疫失调而引起的机体内菌群失调〔7，8〕；此外，老年烧伤病情掩盖是影响老年烧伤患者治疗的另一个重要因素〔9〕。本研究旨在明确老年烧伤患者烧伤后体内病理反应的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料随机选取2014年10月至2015年10月老年烧伤住院患者80例，男59例，女21例，年龄66～75岁，平均(69.8±3.5)岁，患者为中重度烧伤。健康老人30例为对照组，男16例，女14例，年龄65～73岁，平均年龄(68.6±3.1)岁；两组性别和年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)。两组均无神经精神系统疾病、免疫系统疾病、脑血管病及痴呆病史、凝血功能障碍、恶性肿瘤，且近6个月无服用免疫抑制剂药物史。

1.2 血浆和皮肤组织获取于早晨8点左右分别抽取烧伤后0～3 d内、10～13 d内、17～20 d内的患者和健康受试者的血浆，1 700 r/min离心10 min，取血清，将血清冻于-20℃冰箱中备用；取患者烧伤后0～3 d内、7～10 d内、14～17 d内手术切除的烧伤皮肤组织以及整形手术剩余的老人健康的皮肤组织，将皮肤组织置于液氮中储存备用。

1.3 检测方法采用酶联免疫分析法(ELISA)检测两组血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、C反应蛋白(CRP)含量；人IL-1β、IL-6、TNF-α和CRP ELISA检测试剂盒购于R&D公司，实验操作均按说明书操作。将冷冻皮肤组织研磨，采用Trizol法提取皮肤组织的总RNA，以总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物反转录合成cDNA，选用在皮肤组织中稳定表达的β-actin 作为内参，利用real-time PCR 测定两组烧伤皮肤组织和健康皮肤组织中β-catenin、转化生长因子(TGF)-β、激活蛋白(AP)-1 mRNA表达水平，β-catenin上游引物：5′-GACTGGAAGAGCGGAGAGTACTG-3′，下游引物：5′-CCTTGATGGCGTCCAGGTT-3′；TGF-β上游引物：5′-CCGAGATCTCACCAC-3′，下游引物：5′-TCCAGAGCTACATGACACAG-3′；AP-1上游引物：5′-TAGTCCTTCCTACCCCATTCC-3′，下游引物：5′-TTGGTCCTTAGCCACCCTTC-3′；β-actin上游引物：5′-ACATCTGCTGAAGGTGGAC-3′，下游引物：5′-GGTACCACCATACCAGG-3′。将冷冻皮肤组织研磨，采用RIPA裂解液裂解细胞，采用细胞总蛋白提取试剂盒和细胞核蛋白提取试剂盒提取总蛋白和核蛋白，试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司，测定组织中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的酶活，ROS、MDA、SOD、CAT检测试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司；采用Western印迹检测皮肤组织中核转录因子(NF)-κB和转录因子红细胞素-2P45(NF-E2)相关因子(Nrf)2的核积累量及IκB磷酸化水平。兔抗人β-actin、兔抗人IκB和p-IκB抗体购于Cell Signaling Technology公司；兔抗人NF-κB抗体、兔抗人Lamin B抗体购于Affinity公司。

1.4 统计学分析采用SPSS17.0软件进行单因素方差。

2 结果

2.1 老年烧伤患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP水平比较与对照组相比，烧伤患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP水平显著升高(P<0.05)；烧伤后0～3 d内血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP水平与烧伤后7～10 d内无显著差异(P>0.05)；而烧伤后14～17 d内相比于烧伤后0～3 d及烧伤后7～10 d内均显著降低(P<0.05)，见表1。

2.2 老年烧伤患者皮肤组织中ROS、MDA含量和SOD、CAT活性的变化与对照组相比，患者烧伤皮肤组织中ROS、MDA含量显著升高，SOD、CAT活性显著降低(均P<0.05)；烧伤后0～3 d内烧伤组织中ROS、MDA含量及SOD、CAT活性与烧伤后7～10 d内比较无显著差异(P>0.05)；而烧伤后14～17 d内相比于烧伤后0～3 d及烧伤后7～10 d内烧伤组织得到显著改善(P<0.05)，见表1。

2.3 老年烧伤患者皮肤组织中β-catenin、TGF-β mRNA表达水平的变化与正常皮肤组织相比，患者烧伤皮肤组织中β-catenin、TGF-β mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；烧伤后0～3 d内烧伤组织中β-catenin、TGF-β mRNA表达水平与烧伤后7～10 d内比较无显著差异(P>0.05)；而烧伤后14～17 d内相比于烧伤后0～3 d及烧伤后7～10 d内的烧伤组织得到显著改善(P<0.05)。

2.4 老年烧伤患者皮肤组织中IκB磷酸化水平及NF-κB和Nrf2的核积累量的变化与正常皮肤组织相比，患者烧伤皮肤组织中IκB磷酸化水平及NF-κB核积累量显著升高(P<0.05)，Nrf2的核积累量显著降低(P<0.05)；烧伤后0～3 d内烧伤组织中IκB磷酸化水平及NF-κB、Nrf2核积累量与烧伤后7～10 d内比较无显著差异(P>0.05)；而烧伤后14～17 d内相比于烧伤后0～3 d及烧伤后7～10 d内烧伤组织得到显著改善(P<0.05)，见图1。

表1 不同组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP含量及皮肤组织ROS、MDA含量、SOD、CAT活性比较

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与0～3 d组比较：3)P<0.05；与7～10 d组比较：4)P<0.05

图1 不同组皮肤组织IκB磷酸化水平及NF-κB p65、 Nrf2核积累量

3 讨论

烧伤不仅危害了老年患者的皮肤功能，其病理反应还严重影响了机体的内生理功能〔2〕。由于皮肤是非常重要的生理屏障，其破坏会伴随着多种病理反应。当皮肤细胞受到损伤后，细胞会释放磷脂酶、炎症因子、氧自由基等因子，使机体处于高炎症及氧化应激反应的病理状态，这些病理反应严重影响老年烧伤患者病情的发展〔2，10〕。炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的复杂的防御反应，症状表现为局部红肿热痛，病理检查可发现大量炎性细胞如巨噬细胞、粒细胞的局部浸润和组织坏死，其中心环节是血管反应〔2〕。研究表明，烧伤患者体内炎症水平显著升高〔10〕。其原因是烧伤后大量皮肤细胞受到损伤，损伤的细胞释放大量的炎性因子，进一步激活细胞内的溶酶体，激活体内免疫细胞、启动炎症连锁级联反应，最终通过引起广泛的组织和血管内炎症〔10〕。研究表明机体内一些因子如细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和CRP水平能够反映机体内炎症水平〔11〕。NF-κB是一种快反应转录因子，普遍存在于细胞质中，与NF-κB的抑制性蛋白IκB结合而呈非活性状态〔12〕。研究显示，它受多种刺激物，如TNF-κ、IL-1、蛋白激酶C激活剂、有丝分裂原、氧化应激、细菌、病毒、免疫刺激剂等激活〔13〕。激活的NF-κB与IκB解离后入核与靶基因启动子/增强子上的κB位点结合，从而调控许多靶基因的表达，因此被誉为控制早期基因表达的基因开关，炎症反应包括众多分子参与，NF-κB在炎症反应中居于中心地位〔14〕。

氧化应激是指机体ROS的产生过多或(和)机体抗氧化能力下降，ROS的清除不足，导致活性氧在体内增多并引起细胞氧化损伤的病理过程〔15〕。氧化应激的主要特征是组织或细胞内ROS和MDA含量显著升高，而抗氧化酶活性降低〔15〕。当机体处于病理情况下，体内的自由基水平会显著升高，进而引起生物膜脂质过氧化和蛋白质、核酸变性，导致细胞和组织损伤，加速病情〔2，16〕。Nrf2是一个富含亮氨酸拉链结构的转录因子，属于CNC转录因子家族成员，是细胞和机体对抗氧化应激损伤的中枢调控者，普遍表达于各种组织和细胞中，当细胞受到氧化应激损伤时，Nrf2与其抑制蛋白解离，然后进入细胞核，进而激活调控的抗氧化基因表达〔17〕。本研究结果表明，老年烧伤患者烧伤后0～10 d内体内持续处于高氧化应激病理反应状态，而在14～17 d内患者体内氧化应激水平开始显著下降。

此外，研究发现β-catenin、TGF-β能够促进烧伤皮肤的愈合及烧伤皮肤的修复〔18〕。本研究结果表明，老年烧伤患者烧伤后0～10 d内体内促愈合相关蛋白mRNA表达水平显著降低，而在14～17 d内患者体内体内促愈合相关蛋白mRNA表达水平得到显著改善。

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〔2016-12-15修回〕

(编辑滕欣航)

陈海燕(1971-)，女，住院医师，主要从事烧伤后疤痕整形、乳腺整形美容研究。

许涛(1970-)，女，副主任医师，主要从事烧伤后疤痕整形、乳腺整形美容研究。

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