冠心病患者血小板紫外光谱的变化

周 铭 唐海沁 符赵鑫 刘 铭

(安徽医科大学第一附属医院老年心内科，安徽 合肥 230000)

·心、脑血管及代谢性疾病·

冠心病患者血小板紫外光谱的变化

周 铭 唐海沁 符赵鑫 刘 铭

(安徽医科大学第一附属医院老年心内科，安徽 合肥 230000)

目的 观察冠心病患者血小板紫外光谱的变化。方法 检测对象分为冠心病组和对照组，冠心病组包括氯吡格雷组和阿司匹林组。提取血小板体外诱导聚集，采用紫外分光光度计进行扫描得到紫外光谱数据，应用Origin8.0及SPSS13.0软件分析。结果 血小板紫外光谱在204 nm和280 nm波长处可见吸收峰，血小板聚集后在204 nm波长处吸收峰显著大于聚集前；冠心病组与正常组以及冠心病组内氯吡格雷组和阿司匹林组血小板紫外光谱波峰出现位置差异无统计学意义(P>0.05)。结论 紫外光谱可用于临床检测血小板聚集，为其提供一种更为灵敏、准确的测定方法。

血小板聚集；紫外光谱；冠心病

在冠心病发生和发展中，血小板的活化和聚集是重要环节，不仅能够作为诊断冠心病的佐证，也可以用来预测冠心病的风险度〔1〕。临床上，抗血小板治疗作为冠心病治疗的基石，在一级和二级预防都起着至关重要的作用。目前血小板聚集的检测方法由于体内血栓形成环境的复杂性只能粗糙和间接估计血小板聚集情况，不能充分反映血小板聚集的功能状态〔2〕，寻求简单、可行的反映血小板聚集程度的临床检测方法成为心血管研究内容之一。紫外光谱能够在一定程度上反映有机化合物的分子结构，在医学领域中应用广泛〔3〕。本研究应用光谱学原理将紫外光谱检测应用于老年冠心病患者血小板聚集的研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择60岁以上住院服用抗血小板药时间1 w以上的冠心病患者20例，男14例，女6例，平均年龄(78±7)岁，根据服用药物分为氯吡格雷组和阿司匹林组各10例，药物剂量为氯吡格雷75 mg/d或阿司匹林100 mg/d；同时选择10例健康青年志愿者作为对照组，男6例，女4例，平均年龄(24±1)岁。

1.2 仪器与试剂 双光束紫外可见光分光光度计(北京谱析通用仪器有限公司 TU1901)；比色皿(1 mm光程)；超声波清洗器；离心机(Eppendorf Centrifuge 5415R)；10～1 000 μl加样器(德国Eppendorf Research plus)，0.5～10 μl加样器(Flnnplpeffe Y351084027)；真空采血管、EP管；二磷酸腺苷(ADP，美国Sigma公司A2754-100 mg)；花生四烯酸(AA，Sigma公司A9673-10 mg)；无水CaCl2(国产分析纯)；生理盐水。

1.3 实验方法

1.3.1 血小板制备 真空采血管取两组患者2 ml的1∶9柠檬酸钠抗凝血作为样本，用移液器将2 ml血移入EP管后放入离心机离心，采用Alhaloo法二次离心得到血小板沉淀，二次离心时的乏血小板血浆上清(PPP)留200 μl备用：取3 μl于比色皿，再将剩余的PPP与血小板沉淀混匀，然后各取混悬液3 μl于另两个比色皿内。

1.3.2 血小板的诱导聚集 移液器吸取CaCl2及诱导剂加入含3 μl血小板悬液的比色皿内，其中氯吡格雷组加诱导剂ADP、阿司匹林组加AA诱导聚集，并使得最终浓度CaCl210 mmol/L，AA 0.7 mmol/L，ADP 10 μmol/L〔4〕。一份是混匀并充分反应后稀释至4 ml；另一份则是待稀释至4 ml后加入等量的诱导剂，比色皿内PPP血小板稀释后加入CaCl2及诱导剂，反应时间控制在10 min内。正常组加入诱导剂ADP并作同样的处理诱导聚集。

1.3.3 紫外光谱检测 稀释后的血小板充分混匀后放入紫外分光光度计，设置紫外光谱扫描范围200～400 nm，扫描间隔为0.2 nm。基线采用同等量的CaCl2及诱导剂稀释至4 ml校准，保证变量是加入的血小板并消除加入的诱导剂对紫外光谱的影响。检测完后用超声清洗比色皿，防止残留物。实验过程从釆血至上机检测在3 h〔5〕内完成。UVWIN5.0软件将紫外光谱检测数据导出，采用Origin8.0软件作图。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行t及χ2检验。

2 结 果

血小板在紫外区204 nm、280 nm处出现吸收峰，在加用诱导剂后，氯吡格雷组和阿司匹林组，血小板紫外光谱在204 nm波长吸光度显著改变且聚集后吸光度峰值大于聚集前(P<0.05)，见表1。正常组波峰位置出现也在204 nm波长处，与冠心病组比较紫外光谱未见差异。冠心病组与对照组性别差异无统计学意义(P=0.69)。

表1 血小板紫外光谱204 nm波长处吸光值

3 讨 论

血小板具有细胞膜系统和细胞骨架蛋白，特殊的储存颗粒和线粒体、溶酶体等细胞器，而冠心病患者中，血小板的活化标志物CD62p、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅱa受体(PAC)-1等表达率明显高于正常，平均体积和分布宽度也会显著增高〔6〕，可以看出血小板反应紫外光谱是各种物质的综合光谱。以往人单个血小板拉曼光谱的研究其振动峰主要显示的是蛋白质和脂肪的混合峰，也有718 cm-1处磷脂分子C-N键938 cm-1处脂肪链C-C骨架的振动峰〔7〕。我们的结果表明血小板在204 nm和280 nm波长处具有紫外吸收峰，其位置反映的是分别是羧基和蛋白质中的共轭苯环体系，其中204 nm波长处血小板聚集前后的紫外光谱有着显著变化。检索相关文献，发现血小板在近红外光波长420 nm-1有吸收峰〔8〕，并随着血小板浓度改变而变化，尚未发现紫外光谱应用于血小板研究的报道，本研究结果为临床检测血小板聚集程度提供新的参考方法，可依据聚集前后血小板特定波长处紫外吸收峰值的变化占聚集前吸光度的比值来反映血小板聚集率。

血小板在204 nm波长处的改变与血小板的聚集密切相关。在聚集过程中血小板活化膜糖蛋白(GP)会重新分布，膜GPⅡb/Ⅲa分子上的纤维蛋白原结合位点暴露，最终与纤维蛋白原的α链中的RGD肽序和γ链C端十二肽结合，通过信号转导使相邻的血小板聚集〔9〕。GP的产生和转移以及GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原氨基酸残基的结合等聚集过程中发生的反应，不仅有化合键的形成而且伴随着氨基酸羧基的变化，引起聚集后反应羧基204 nm波长处吸收峰值增大。在重复的实验中发现，当由于取样误差聚集后的血小板量略小于聚集前时(以280 nm处吸收峰值为标准)，仍可得这一结果。而且，实验中充分稀释的诱导剂与血小板混合几乎不会引起血小板的聚集〔10〕，依此来模拟聚集前的血小板，确保其紫外光谱与聚集后具有可比性，同时也加入了乏血小板的比较，能对比观察消除血浆成分对血小板光谱的影响，使实验结果更为准确。目前，检测血小板聚集功能，临床上应用最为广泛的是光比浊法，利用血小板聚集仪测定血小板聚集前后血浆透光率变化来间接反映血小板聚集率，但有不足：高脂血症等其他影响血清透明度的因素会影响血小板吸光度；只能检测较大的血小板聚集物，敏感性不高，因而比浊法不能够准确反映血小板的聚集功能〔11〕。散射性粒子检测法利用40 μm波长为675 nm的激光束透射到聚集颗粒发生反射，能够很灵敏地检测到血小板颗粒的大小及数量，但聚集颗粒不能全面反映凝血功能。血小板功能分析仪对纤维蛋白原缺陷性疾病诊断灵敏度低〔12〕，而剪切诱导法受温度和血小板数目影响较大，电阻抗法因电极的放置则要求难以满足临床需要且灵敏度低，应用较少〔13〕。血栓弹力图作为一种新型的床旁血小板聚集率检测方法，运用血液凝固牵拉的原理，能够直接使用全血检测全面地分析血液凝固及溶解过程〔14〕，但检测费用较高。紫外光谱检测法有着很高的灵敏度，在无紫外吸收的溶剂中可达0.005%，实验中也可以观察到3 μl血小板血浆在204 nm处即有明显吸收峰，而且多次实验重复性高，因而能够更准确地反映血小板的聚集功能〔15〕。本研究显示紫外光谱主要揭示的是共轭体系等官能团间的关系，具有一定的局限性。实际上，氯吡格雷代谢产物与P2Y12受体会形成二硫键〔16〕，纤维蛋白原分子的α、β和γ链也是通过29对二硫键连接，阿司匹林会抑制AA环氧化酶使丝氨酸乙酰化〔17〕。红外光谱利用分子振动能够产生许多窄带吸收，相比下能够更多地反映官能团的种类及包含结构。Tablin等〔18〕发现了寒冷刺激的活化血小板膜-CH2区具有不同红外吸收，而冠心病患者血小板也处于活化状态，比较冠心病与正常人血小板红外光谱-CH2区的振动变化，对于冠心病的诊断具有重要意义。

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〔2015-09-12修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

安徽省科技攻关项目(12010402116)

唐海沁(1956-)，男，硕士，主任医师，博士生导师，主要从事冠心病血小板功能的研究。

周 铭(1989-)，男，硕士，主要从事冠心病血小板功能的研究。

R318.51

A

1005-9202(2017)11-2661-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.026