基于间接竞争法的表面等离子共振免疫传感技术检测雌二醇

2017-06-22贾映彤白家磊张希浩宁保安高志贤崔建升

食品科学 2017年12期

贾映彤，彭媛，白家磊，张希浩，宁保安，高志贤,*，崔建升*

（1.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津 300050）

贾映彤1,2，彭媛2，白家磊2，张希浩2，宁保安2，高志贤2,*，崔建升1,*

建立一种基于间接竞争法的表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）免疫传感技术检测雌二醇（estradiol，E2），这种方法无需标记，可以实时监测竞争过程。在间接竞争实验中，E2和E2的单克隆抗体（monoclonal antibody，E2-mAb）等体积混合后共同竞争被固定在了SPR传感器的芯片表面的E2-牛血清白蛋白包被原（E2-bovine serum albumin，E2-BSA），SPR产生的信号和E2的质量浓度呈反比。优化实验参数如抗体质量浓度、再生次数等，最后再用全脂牛奶做E2的加标实验。实验的线性范围为15.63～500 ng/mL，最低检出限为11.13 ng/mL。本研究的SPR免疫传感技术构建了一种通用的方法，可以用来无标记检测其他不同的小分子。

表面等离子共振；无标记；雌二醇；实时；间接竞争

雌二醇（estradiol，E2）属于环境内分泌干扰物[1]，是一种自然产生的雌激素[2]。现今越来越多的养殖场在饲料中会加入过量的E2作为生长促进剂来促进动物食欲、增加动物体重、使蛋白转化率提高来增加瘦肉比率从而提高产率[3]。但是过量的E2会通过食物链富集在如牛奶、鸡肉等动物性农产品中，对人体造成严重的危害。E2会使男性的生殖系统发育和功能异常，精子数量和质量下降[4]，严重时甚至引发尿道下裂、性腺萎缩和睾丸癌等疾病[5]。研究表明，长期暴露在雌激素下的职业男性患阳痿的几率会大大增加[6]。而外源性的E2也会引起女性的月经不调、卵巢萎缩等疾病，引起流产甚至不孕、子宫内膜异位，卵巢癌等疾病，女性组子宫肌瘤、宫颈癌等疾病也被证实与E2有关[7]。E2的残留还会使女性儿童提前发育，男性儿童乳腺发育呈女性化的趋势[8]，由于婴幼儿身体的组织和器官血液分布尚未建立用来阻止或减缓外部污染物的屏障[9]，所以E2对婴幼儿和青少年儿童比成人的毒性更大。因此，考虑到食品安全问题，需要有效的检测技术来检测E2。

目前针对食品中的E2的检测方法众多，主要包括如化学发光[10]、气相色谱法[11]、气相色谱-质谱法[12]，高效液相色谱[13]、液相色谱-质谱联用法[6]，然而这些方法需要繁琐的程序和复杂的预处理过程[143]，所以不适合快速和实时检测食品中的E2残留。最近十几年，不同的生物方法被用于检测E2，如酶联免疫分析[15]、电化学传感器[16]、酶热传感器[17]和表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器等[18]。

现在SPR传感器由于其无需标记、可以实时快速动态检测的优点[19]已经成为了最有希望用于生物痕量检测的技术之一[20]。当传感器芯片表面和分析物发生反应时，SPR传感器可以精确检测到折射率的变化[21]，SPR传感技术已经得到了深入的研究和广泛的应用。SPR传感器研究对象最初主要是病毒、蛋白质、DNA、抗体、抗原、药物、细胞、多肽、RNA类脂等物质，而随着科学技术的进步，SPR传感技术在环境监测[22]、食品安全[23]、遗传分析[24]等领域得到了广泛的应用。

本实验基于间接竞争法利用SPR免疫传感技术定量检测E2，将完全抗原固定在芯片表面之后注入靶标小分子与一定质量浓度抗体的混合液，使表面固定的完全抗原和溶液中的被测分析物竞争结合溶液中抗体，所以当溶液中被测分析物质量浓度减少时，芯片表面抗原结合的抗体就变多，SPR的响应信号就大，即SPR传感器的信号变化与被测物的质量浓度呈反比。实验优化了E2-mAb、E2-BSA质量浓度、再生次数、再生液等条件，以牛奶为试剂样品做了加标回收实验，拟建立一种基于间接竞争法的SPR免疫传感技术检测E2的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全脂奶天津市购。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、浓盐酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐温20、乙醇胺等试剂均为国产分析纯；E2、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、羟基丁二酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）百灵威科技有限公司；E2-BSA、E2-mAb由实验室自制[25]。

E2-mAb用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4，用前超声脱气）溶解；E2-BSA溶解于0.01 mol/L的醋酸盐缓冲液（NaAc-HAc，pH 4.5）中；E2溶解于含5%甲醇的PBS中；封闭液为1 mol/L，pH 8.5的乙醇胺溶液。

1.2 仪器与设备

Autolab ESPRIT SPR传感器荷兰Eco Chemie B.V.公司；AL-204分析天平美国Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 E2包被原的固定及其稳定性分析

将SPR芯片（表面镀有金膜）用预先配制的Pirahha洗液（V（H2SO4）∶V（H2O）=7∶3）浸泡1～2 h以除去所有的有机物质，使金芯片羟基化[26]，取出洗净，氮气吹干。将洁净的SPR芯片浸入1 mmol/L 11-巯基十一烷（11-mercaptoundecanoic acid，MUA）溶液中，室温过夜，使芯片上自组装上羧基，取出后用去离子水和无水乙醇交替冲洗，氮气吹干。

将SPR芯片装入传感器中，以pH 4.5的醋酸盐缓冲溶液做为偶合缓冲溶液，在反应池中依次加入0.4 mol/L的EDC和0.1 mol/L的NHS溶液来活化芯片表面的羧基，用来进行抗原的固定。之后用偶合溶液配制一定质量浓度的E2-BSA，以pH 8.5的乙醇胺为封闭液，0.05 mol/L的NaOH溶液为再生溶液，缓冲溶液作参比。将这些溶液加入样品池进行固定化程序。

E2-BSA固定好后，每天检测同一质量浓度的E2抗体（14.22 µg/mL），考察E2-BSA的稳定性。

1.3.2 间接竞争实验

检测流程如图1所示。将一定质量浓度的抗体，与不同质量浓度的E2标准液等体积混合后室温孵育加入样品池中（混合后E2终质量浓度分别为3.91、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 ng/mL）使E2和E2-BSA共同竞争E2-mAb，然后分别测定SPR响应值。在循环测试后会用再生液将和E2-BSA结合的E2-mAb洗掉从而对芯片进行再生。为保证检测结果的重复性，每次实验均测量3 次。

图1 间接竞争法的检测流程Fig.1 Schematic diagram of estradiol detection, including E2-BSA immobilization, E2and E2-BSA competition for E2-mAb and regeneration

1.3.3 特异性实验

选择E2的结构和功能类似物：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚、雌酮和雌三醇。将这些物质分别配制成不同质量浓度梯度的标准溶液，用间接竞争法进行检测，考察该方法的特异性。

1.3.4 牛奶样品的处理

奶样中每100 mL含蛋白质3.0 g、脂肪3.5 g、碳水化合物5.0 g、钠50 mg。1 mL不同质量浓度的E2标准液分别加入1 mL的牛奶样品中，然后加入等体积的乙酸乙酯到牛奶样品，因为相似相溶原理从而将其中的E2萃取出来。轻轻振荡静置至分层，取上层乙酸乙酯并用氮气吹干，最后用1 mL含5%甲醇的PBS定容。

2 结果与分析

2.1 E2-BSA的固定质量浓度的优化

图2 不同质量浓度的E2-BSA产生的SSPPRR信号Fig.2 SPR signal response to different E2-BSA concentrations

不同质量浓度的E2-BSA与SPR信号变化关系如图2所示，可以看出随着E2-BSA质量浓度的增加，传感信号变化增大，这说明E2-BSA在芯片表面的固定量逐渐增大，在1.0 mg/mL处固定量几乎接近饱和，所以选择1.0 mg/mL为E2-BSA的最佳固定质量浓度。

由于E2-BSA固定在SPR的芯片表面之后，不可能再将其取出保存到4 ℃中，只能加入PBS密封保存，所以有必要考察E2-BSA在该保存条件下的稳定性。在SPR芯片表面固定优化好的质量浓度即1 mg/mL的E2-BSA，然后每天测定混合后质量浓度为7.11 µg/mL抗体产生的SPR响应。将第1次检测到的SPR信号记为R0，以后每天检测到的SPR信号记为R，以R/R0为纵坐标，作为对稳定性的参考，结果如图3所示。从图3可以看出，第5天时仍能产生75%以上的响应，第7天才降至50%以下，表明直接固定在芯片上的E2-BSA稳定性良好。

图 33 EE2-BSA的稳定性Fig.3 Study of antigen stability

2.2 最佳抗体质量浓度的选择

将一系列质量浓度梯度稀释的E2-mAb分别加入样品池，使抗体和E2-BSA特异性结合，之后用PBS冲掉非特异性吸附，以PBS为参比溶液，观察SPR信号，最终确定最佳使用质量浓度。

间接竞争反应中抗体用量应遵从的原则：为使待测液中的E2小分子与芯片表面固定的E2-BSA能够有效地与E2-mAb竞争，所用抗体的量需要接近其和芯片表面抗原特异性结合时达到饱和时的用量[27]。用不同的抗体质量浓度和对应的SPR信号变化如图4所示，可以看出混合后最终质量浓度为7.11 µg/mL的E2-mAb就可以产生足够的SPR响应信号，曲线也进入平台期，说明芯片表面结合的抗体趋于饱和，所以选择7.11 µg/mL的抗体作为最佳质量浓度抗体进行下一步实验。

图4 不同质量浓度抗体产生的SPR信号Fig.4 SPR signal with different concentrations of E2-mAb

2.3 再生条件的优化

分别用0.1 mol/L盐酸溶液、0.1 mol/L盐酸+0.1% SDS溶液、0.1 mol/L盐酸+0.1% TritonX-100、0.05 mol/ L NaOH溶液进行再生，每次再生时为120 s。

通过实验发现，0.05 mol/L NaOH溶液可以去除99.70%的结合抗体。0.1 mol/L盐酸+0.1% SDS溶液可以去除97.03%的结合抗体，而0.1 mol/L盐酸+ 0.1% Triton X-100可以去除98.57%的结合抗体，0.1 mol/L盐酸溶液能去除94.10%的结合抗体。所以选择0.05 mol/L NaOH溶液作为再生液。

同时研究再生次数对金膜表面的E2-BSA活性的影响。检测同一最终质量浓度为7.11 µg/mL的抗体，以0.05 mol/L NaOH溶液为再生液。由图5可以看出，经过38 次的再生，抗体产生的信号同第一次的信号比较依然在75%以上，表明固定在SPR芯片上的抗原在多次再生之后依然可以保持良好的活性，重复性良好。

图5 再生次数对E2-BSA稳定性的影响Fig.5 Influence of number of regenerations on the stability of E2-BSA

2.4 间接竞争实验结果

E2-BSA固定化质量浓度为1.0 mg/mL，将14.22 µg/mL的抗体，与一系列质量浓度梯度的E2标准液（3.1～1 000 ng/mL）等体积混合，进行间接竞争实验，监测曲线如图6所示，包括基线、竞争、洗去非特异性吸附和再生。

图6 SPR间接竞争实时监测曲线Fig.6 Real-time monitoring curve of indirect competition

间接竞争结果如图7a所示，可以看出随着E2质量浓度的增加，SPR传感信号显著降低，竞争明显。以E2小分子质量浓度为0时的SPR响应值为R0，一定质量浓度E2的响应值为R，抑制率/%＝（R0－R）/R0×100。以E2质量浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，对E2质量浓度取对数即以lgC（E2）绘制间接竞争抑制曲线（图7b）。

图7 不同质量浓度E2的SPR信号（a）和间接竞争抑制回归曲线（bb）Fig.7 Indirect competition results (a) and indirect competitive inhibition regression curve (b)

根据3 倍信噪比（RSN=3）原理，计算出方法的最低检出限为11.13 ng/mL。检测范围为15.63～500 ng/mL，y=0.200 3x－0.125 56，R2为0.996 82。

此外，将其他检测E2的方法测定的检出限和线性范围同本实验方法做了对比，结果如表1所示，和其他方法相比，本实验拥有更低的检测限和更宽的线性范围。并且本实验无需标记，可以实时观察信号的变化和竞争的情况，一次间接竞争的过程仅需要约20 min。2.5 加标回收实验结果

表1 其他方法和本实验方法的比较Table1 Comparison of the developed label-free immunoassay with other reported methods for the detection of E

首先参照赵金莲等[30]的实验，通过高效液相色谱分析验证了牛奶样品中并无E2检出，未加标准品和加了E2标准品（250、125、62.5、20.0 ng/mL）的经过简单处理的牛奶样品用间接竞争法计算加标回收率，每个质量浓度水平平行测定6 次。在用乙酸乙酯萃取时奶中的脂肪等有机物质可能也被萃取出来，但是由于本实验原理依据抗原抗体特异性结合的原理，即小分子和抗原只和体系中的抗体竞争结合不会和萃取出的有机物质结合，并且在SPR检测程序中可以去除非特异性吸附，所以牛奶中的某些脂肪等物质对加标回收率实验影响很小。如表2所示，加标回收率在90.57%～8.47%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在4.65%～12.28%之间，说明该方法准确可靠，也证明了可能被萃取出的脂肪等有机物质不会影响实验结果，可以用于实际牛奶样品的测定。在实际应用中如果待检测的样品E2质量浓度较低时，可以采取一个富集浓缩的步骤来检测E2残留。

表 22 EE2加标回收实验Table2 Recovery of E2from spiked milk

2.6 特异性实验结果

选择E2的功能结构和类似物：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚、雌酮和雌三醇进行特异性实验。将各类似物的不同质量浓度的标准溶液、5 种类似物和E2的混合液（即6 种物质全部混合，混合液中6 种物质质量浓度相同，分别是500、250、125 ng/mL）分别与E2-mAb等体积混合（混合后的最终质量浓度分别为250、125、62.5 ng/mL），然后用与2.4节相同的方法进行间接竞争法进行检测，结果如图8所示，抑制率反映了各目标物与E2-mAb之间的反应程度，抑制率越高，表明目标物与抗体结合的越多。所有类似物的抑制率均低于7%，表明它们几乎不与抗体结合，并且6 种混合物的特异性与只有E2的特异性基本一致，所以其他类似物对检测E2几乎无影响。该方法的特异性良好。

图8 E8 E2及其类似物的特异性实验结果Fig.8 Specificities for E2and its analogues

3 结论

建立了基于间接竞争法的无需标记的用于检测E2残留的SPR免疫传感技术，得到了良好的回收率和线性范围。在优化条件下，得到了15.63～500 ng/mL的线性范围，最低检出限为11.13 ng/mL。与传统的检测方法相比，样品的前处理过程操作简单、耗时少（单个样品约20 min），具有可观的应用前景。检测中以固定在芯片上的抗原为传感层，实现了更换抗原-抗体即可更换检测目标物的目的，这样使这一传感技术有良好的通用性，即本研究提供了一种简单实时无需标记的方法可以用于检测其他类型的小分子。

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A Label-Free Immunoassay with a Surface Plasmon Resonance Biosensor for the Determination of Estradiol in Milk

JIA Yingtong1,2, PENG Yuan2, BAI Jialei2, ZHANG Xihao2, NING Bao’an2, GAO Zhixian2,*, CUI Jiansheng1,*
(1. School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety, Institute of Health and Environment Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, China)

A surface plasmon resonance (SPR) biosensor system was developed for the determination of estradiol (E2) using an indirect competition method without labeling in real time. In the indirect competition method, the antigen (E2-BSA) was immobilized on the sensor chip surface and competed with E2in samples for binding with the antibodies. Then the SPR response decreased in the presence of E2, which prevented the coupling of antibodies and E2-BSA, and so the SPR response was inversely proportional to E2concentration. Assay parameters, including antibody concentration and number of regenerations, were optimized and E2-spiked milk samples were detected by this method. A linear relationship was obtained between inhibition percentage and common logarithmic value of E2concentration over the range of 15.63 to 500 ng/mL and the limit of detection (LOD) was 11.13 ng/mL. The present study demonstrated a simple and general strategy for label-free detection of various small molecules.

surface plasmon resonance (SPR); label-free; estradiol; real-time; indirect competition

10.7506/spkx1002-6630-201712034

X836

1002-6630（2017）12-0223-06

贾映彤, 彭媛, 白家磊, 等. 基于间接竞争法的表面等离子共振免疫传感技术检测雌二醇[J]. 食品科学, 2017, 38(12)： 223-228.

10.7506/spkx1002-6630-201712034. http：//www.spkx.net.cn

JIA Yingtong, PENG Yuan, BAI Jialei, et al. A label-free immunoassay with a surface plasmon resonance biosensor for the determination of estradiol in milk[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 223-228. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712034. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-20

国家自然科学基金青年科学基金项目（21207161）；国家自然科学基金面上项目（81472985）；军队重大专项（AWS15J006）；天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（15JCYBJC51200）

贾映彤（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：15614135637@163.com

*通信作者：高志贤（1966—），男，研究员，博士，研究方向为纳米技术、食品安全和生物传感器。E-mail：gaozhx@163.com崔建升（1966—），男，教授，博士，研究方向为环境监测技术。E-mail：cui1603@163.com