完全发酵与适度发酵苹果醋主要成分的差异性分析

薛淑琴，谢思芸，肖仔君，钟瑞敏,,*，邓泽元，江啟鑫

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005）

完全发酵与适度发酵苹果醋主要成分的差异性分析

薛淑琴1，谢思芸2，肖仔君2，钟瑞敏1,2,*，邓泽元1，江啟鑫2

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005）

研究苹果醋分别采用适度发酵和完全发酵时主要成分及芳香物质种类和含量的差异性。采用福林-酚法、高效液相色谱法、固相微萃取结合气相色谱-质谱联用分别测定2 种发酵方式苹果醋中总酚、有机酸含量和芳香成分。结果表明，适度发酵苹果醋总酚含量比完全发酵高21%；2 种果醋的有机酸种类完全一致，但适度发酵法中的酒石酸、柠檬酸和富马酸含量更高，而丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸和琥珀酸的含量则略低于完全发酵的醋样。适度发酵苹果醋芳香物质种类更丰富，检测到37 种芳香成分，其中保留了不少原果香气，如香茅醇、橙花醇、乙酸丁酯、乙酸-4-甲基-3-己酯和乙酸二甲基丁酯等。适度发酵可减少苹果醋总酚的损失，同时保留了更多的苹果原香物质，是值得探索改善苹果醋品质的途径。

苹果醋；适度发酵；完全发酵；总酚；有机酸；芳香物质

苹果醋是醋饮料、调味品和功能食品行业广泛使用的重要原料，2014年我国果醋年产量已接近15万 t，其中苹果醋是产量最大的品种[1]。我国市场上苹果醋饮料的种类繁多，真正以发酵为基础的苹果醋并不多见，大多为纯原料调配型苹果醋饮料，有的甚至是用醋精、糖精、香精调配而成[2]。

苹果醋以苹果汁为原料，通过酒精发酵和醋酸发酵完成酿造，全球工业化生产果醋主要采用液体深层发酵技术为主[3-4]。果醋的营养风味品质主要来源于糖类等成分在发酵过程中微生物的转化与代谢副产物，以及水果原有的植物营养素、天然原果香气、天然色素和维生素等，而糖类完全转化为醋酸固然重要，但不应是根本目的[5]。相反，在好氧的醋酸发酵阶段，在满足果醋产品乙酸转化率指标后，如能缩短发酵时间实行适度发酵，控制发酵过程中酒精体积分数和乙酸浓度，避免持续氧化代谢所形成的不良风味，尽量减少发酵基质中长时间的化学氧化作用对多酚等植物营养素、天然原果芳香和天然色素等的破坏，将显著提升果醋的保健和风味品质。

有机酸是苹果醋中重要的营养、风味和特征成分，赋予了果醋特有的风味[6]。有机酸的来源有两部分；一部分是苹果原料中固有的，如酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸；一部分是发酵产生的，如乳酸、丙酮酸、乙酸、α-酮戊二酸等[7-9]。挥发性香气成分是构成香味的主要方面，是果醋直观和重要的感官品质[10-12]。果醋中的挥发性芳香成分主要有酸、醇、酯、醛、酮、萜、萜烯类[13-14]等。

目前鲜见苹果醋采用适度发酵改善品质的研究报道。本实验通过对适度发酵和完全发酵苹果醋中总酚、有机酸以及芳香物质种类和含量的差异性分析，旨在探索苹果醋采用适度发酵以提高其品质这一新途径的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果 市购；活性干酵母（LALVIN/ICV 71B）法国拉曼公司；恶臭醋酸杆菌 广东省菌种保藏中心；酒石酸、丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸有机酸标准品 北京百灵威科技有限公司；甲醇（色谱纯） 天津市科密欧试剂有限公司；福林-酚试剂 上海荔达生物科技有限公司；没食子酸标准品 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

BIOQ-20L发酵罐 上海汇和堂生物工程有限公司；高效液相色谱仪（SPD-16双波长紫外检测器、Shimadzu数据处理系统）、QP 2010-Ultra气相色谱-质谱联用仪、AUW 120D分析天平 日本岛津公司；57328-U固相微萃取头、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/ CAR/PDMS）萃取纤维、手动进样手柄 美国Supelco公司；TGL-20M-Ⅱ高速冷冻离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司；Omni-G超纯水发生器 锐思捷科学仪器有限公司；TU-1901紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 完全发酵苹果醋

以苹果为原料，经洗净、热烫、护色、榨汁、酶解、过滤等工序得到苹果原汁。将苹果原汁糖度调整为20%，添加果汁质量0.08%的活性干酵母在28 ℃条件下发酵。发酵至136 h后，酒精体积分数不再变化，滤掉酵母泥进行醋酸发酵，接种果酒体积分数10%的醋酸菌于苹果酒中，发酵至168 h后，醋酸酸度不再上升，停止发酵。

1.3.2 适度发酵苹果醋

调整苹果原汁糖度至15%，添加果汁质量0.04%的活性干酵母在28 ℃条件下发酵，48 h发酵终止。滤掉酵母泥进行快速醋酸发酵，接种果酒体积分数7%的醋酸菌于苹果酒中，当发酵48 h酸度达到2%时停止发酵。

1.3.3 苹果醋中总酚含量的测定[15]

准确称取没食子酸标准品12.1 mg，甲醇定容至100 mL。精密吸取1、2、3、4、5、6、7 mL没食子酸标液，加水稀释定容于10 mL棕色容量瓶得不同质量浓度标液，分别取1 mL不同质量浓度标液加水稀释，加入0.6 mL福林-酚试剂，涡流，3 min后加入20%碳酸钠溶液1.5 mL，30 ℃避光反应60 min。于波长750 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸标样质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。绘制标准曲线得回归方程为y=0.185 04x+0.155 7（R2=0.995）。取1 mL样液按标准方法测定。计算完全发酵和适度发酵苹果醋中总酚含量。1.3.4 苹果醋中有机酸含量的测定

有机酸含量的测定参考余永建[16]、向进乐[17]等的方法略作改动。精确称取酒石酸0.1 g、丙酮酸0.05 g、苹果酸5 g、α-酮戊二酸0.5 g、乳酸0.2 g、乙酸10 g、柠檬酸0.25 g、富马酸0.01 g、琥珀酸0.4 g；超纯水溶解，定容于100 mL。配制成混合标准溶液。分别取0.1、0.2、0.5、2、4、6、8 mL混合标准溶液，超纯水定容于100 mL。得到不同质量浓度的混合标准溶液。系列梯度混合标准液过0.22 μm水系滤膜后采用高效液相色谱法对其进行测定分析，以峰面积（X）对质量浓度（Y）求回归方程，绘制标准曲线。

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱：Inertsail ODS-4（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲液（磷酸调pH值至2.8），流动相过0.22 μm水系滤膜，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm，进样量10 μL。

1.3.4.2 样品溶液的制备

分别取完全发酵24、48、72、96、120、144、168 h；适度发酵10、18、24、34、42、48 h的苹果醋样品，12 000 r/min高速冷冻离心10 min，滤液过0.22 μm水系滤膜。滤液上机分析（10 μL），外标法定量。

1.3.5 苹果醋挥发性物质的测定

1.3.5.1 固相微萃取

在2 0 m L装有磁力搅拌子的顶空瓶中加入1.00 g NaCl，5 mL适度发酵48 h苹果醋液和完全发酵168 h苹果醋液，50 ℃平衡10 min，插入PDMS纤维头，50 ℃吸附40 min，气相色谱-质谱进样口解吸5 min。

1.3.5.2 色谱条件

色谱柱：Rxi-5sil MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气He，流量1 mL/min；进样口温度250 ℃；程序升温：起始柱温35 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至80 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升温至180 ℃，保持2 min，以16 ℃/min升温至240 ℃，保持1 min；分流比10∶1。

1.3.5.3 质谱条件

电子电离源；离子源温度220 ℃；接口温度250 ℃；质量扫描范围m/z 35～500。通过质谱解析以及与NIST14 a.L谱库进行比对，确定各易挥发成分的结构，并采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 19数据处理软件对实验结果进行处理，结果用±s表示。

2 结果与分析

2.1 适度发酵苹果醋和完全发酵苹果醋总酚含量的变化

图1 适度发酵与完全发酵苹果醋中总酚含量的差异Fig.1 Comparison of total phenol contents in moderately and entirely fermented apple vinegar

由图1可以看出，适度发酵和完全发酵苹果醋中，随着发酵时间的延长，2 种不同发酵方式中的总酚含量均下降，醋酸菌属于好氧菌，这是由于在醋酸发酵阶段，发酵过程中提供充足的氧气，发酵液中易受到氧化的维生素和酚类物质发生不可避免的损失[18]。完全发酵苹果醋中酚类物质的损失较适度发酵更为严重，完全发酵苹果醋基料苹果汁的固形物含量较高，在酒精发酵阶段，高浓度的糖含量对酵母菌的抑制作用比较显著，果汁中的酚类物质没有很好的溶出；醋化阶段，长时间的好氧发酵使得酚类的损失很大，发酵结束，总酚含量仅为48.63 mg/100 g。适度发酵果醋基料苹果汁中固形物含量调整到合适的浓度，酒精发酵阶段，酵母菌的生长比较旺盛，可溶性酚类物质由于酵母菌的疏松作用溶出[19]，醋化阶段，明显缩短了发酵时间，避免了发酵液长时间的通氧，所以总酚的损失较低。发酵结束，总酚含量为58.27 mg/100 g。

2.2 适度发酵和完全发酵过程中9 种有机酸含量的变化

图2 适度发酵和完全发酵苹果醋9 种有机酸含量的变化Fig.2 Changes in the contents of nine organic acids in moderately and entirely fermented apple vinegar

酒石酸是苹果果实和发酵产物中共有的有机酸，由图2a可知，发酵初期，酒石酸含量增加，这可能是发酵体系中pH值偏低，pH值越低，酒石酸盐的溶解度越大，能检出的酒石酸含量就越高，酒石酸含量增加[20]。所以，适度发酵中酒石酸含量显著增加。而完全发酵后期，酒石酸含量显著下降，可能是酒石酸盐沉淀、酒石酸氧化降解[21]。

丙酮酸是生物体基本代谢的产物之一，如图2b所示，适度发酵中，丙酮酸含量下降显著，可能是适度发酵的营养基质更加适宜醋酸菌生长代谢，醋酸菌的代谢旺盛。完全发酵后期，丙酮酸的含量显著下降。

α-酮戊二酸是微生物代谢产生的微量有机酸[22]，如图2c所示，适度发酵和完全发酵中，α-酮戊二酸较发酵开始含量显著增加，完全发酵中α-酮戊二酸含量显著高于适度发酵，可能是在酒精发酵阶段，完全发酵时间长，酵母菌积累更多的α-酮戊二酸。适度发酵过程后期，α-酮戊二酸的变化趋势较缓。

苹果酸是苹果醋中的特征性有机酸，如图2d所示，适度发酵中，苹果酸含量先显著增加，后降低。完全发酵过程中苹果酸的减少量更为显著，可能是到发酵后期，醋酸菌的营养底物被不断消耗，苹果酸作为碳源而被消耗。

乳酸是发酵产生的有机酸，如图2e所示，酒精发酵阶段，乳酸大量积累，所以，完全发酵中乳酸含量高于适度发酵。适度发酵到中期，乳酸含量显著下降，可能是醋酸发酵阶段，醋酸菌的作用，抑制了乳酸菌的活性，醋酸菌把前期积累的乳酸当做营养底物而消耗。完全发酵中，发酵初期，乳酸含量下降显著，随后，乳酸含量变化不显著。

乙酸发酵阶段，酒精作为底物，将其转化为乙酸，乙酸含量显著升高。由图2f可知，适度发酵和完全发酵醋酸的变化趋势一致。适度发酵中乙酸含量达到1 494.36 mg/100 g。完全发酵中乙酸含量达2 806.18 mg/100 g。

如图2g所示，完全发酵中柠檬酸含量有所增加，可能是发酵过程从皮渣中溶出。适度发酵柠檬酸的变化不显著。

如图2h所示，富马酸含量变化不显著。富马酸含有不饱和的碳碳双键结构，完全发酵过程中，持续的通氧可能有氧化损失。适度发酵法富马酸含量的变化不显著。

琥珀酸是动物、植物以及微生物中的一种常见的中间代谢产物[23]。由图2i可知，发酵初期，完全发酵苹果醋中琥珀酸含量高于适度发酵苹果醋，这可能是在酒精发酵阶段，酵母菌进行厌氧呼吸，琥珀酸是糖类转化为酒精时积累的副产物。在醋酸发酵阶段，完全发酵和适度发酵中琥珀酸含量显著下降，这可能是氧化降解。

2.32 种发酵苹果醋挥发性成分比较分析

对2 种发酵方式发酵终止后样品和发酵前的苹果汁芳香物质进行了固相微萃取联合气相色谱-质谱法比较分析，如图3所示，对相对含量高于0.05%以上各组分经检索分析，各成分相对含量见表1。液态深层适度发酵与完全发酵苹果醋芳香物质存在明显差异。

图3 苹果汁和苹果醋芳香物质GC-MS总离子流图Fig.3 Total ion current chromatogram of volatile aromatic components in apple juice and apple vinegar

表1 适度发酵和完全发酵苹果醋香气成分Table1 GC-MS analysis results of aromatic components in apple vinegar samples prepared by moderate and entire fermentation methods

续表1

如表1所示，适度发酵的苹果醋样品芳香物质丰富性明显优于完全发酵。适度发酵苹果醋中鉴定出37种香气成分，其中有11 种酯类（总相对含量为63.72%）、8 种醇类（10.26%）、6 种醛酮类（4.15%）、7 种萜烯类（3.04%）和3 种酸类（17.15%）。而完全发酵样品只鉴定出22 种成分，其中有7 种酯类（19.14%）、1 种醇类（55.07%）、9 种醛酮类（23.74%）、2 种萜烯类（0.75%）和1 种酸类（0.45%）。导致这种情况的主要原因是适度发酵保留了较多苹果汁和前期果酒的原香成分，如己醇、2-庚醇、（±）-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、1,3-辛二醇、乙酸丁酯、乙酸-2-甲基丁酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香茅醇、大马士酮、反-橙花叔醇等苹果汁或酒中成分有一定程度保留，而在完全发酵醋样中这些成分则完全消失。这种果汁、果酒原香风味在液态深层完全发酵果醋中损失的情况比较普遍，主要与完全发酵长时间供氧的氧化作用和蒸腾作用有关，这也是液态深层完全发酵苹果醋缺乏苹果原香特性的主要原因[24-26]。

适度发酵与完全发酵苹果醋芳香特征成分的种类及相对含量也存在很大差异。适度发酵醋样相对含量比较高的芳香特征成分包括：乙酸-4-甲基-3-己酯（40.32%）、乙酸异戊酯（11.89%）、癸酸（10.75%）、辛酸（6.30%）、乙酸苯乙酯（6.12%）、乙酸-2-甲基丁酯（3.46%）、苯乙醛（2.06%），其中大部分是酯类成分，相对含量总和达到63.72%。完全发酵苹果醋样特征成分包括：苯乙醇（55.07%）、乙酸苯乙酯（14.75%）、苯甲醛（13.65%）、苯乙醛（3.91%）、乙酸-4-甲基3-己酯（3.28%）、对乙基苯甲醛（3.10%），大部分为醇类和醛酮类，总和达到78.81%，而酯类成分总和仅有19.14%。从感官品评结果，适度发酵苹果醋除了保留明显的苹果原香特性外，香感比较柔和，而完全发酵醋样香感具有一定刺激性[27-30]，且基本没有苹果原香。

从以上分析结果来看，发酵方式的不同确实会对苹果醋风味成分的种类、相对含量及相互间的比例产生重大影响，进而影响到各自的风味特性。适度发酵与完全发酵方式在初始发酵基料的成分（如酒精体积分数、含糖量等）、发酵时间和供氧量上存在很大区别，会影响醋酸菌的繁殖和代谢特性，最终影响到原香风味成分的保留以及代谢性芳香物质种类与含量，这方面值得以后继续深入研究。

3 结 论

通过对比适度发酵和完全发酵过程中苹果醋总酚含量的变化，发现完全发酵苹果醋中总酚的损失较为严重，而适度发酵苹果醋的营养基质更加适宜酵母菌、醋酸菌生长、繁殖，果皮、渣中的总酚能够更好的溶出，而且明显缩短了发酵时间，避免了总酚的大量损失。

完全发酵和适度发酵中有机酸的种类一致，酒石酸、柠檬酸、富马酸含量高于完全发酵，丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、琥珀酸含量略低于完全发酵，适度发酵中乳酸、丙酮酸、乙酸含量显著低于完全发酵，从保留苹果醋营养价值而言，适度发酵法是可行的。

2 种不同发酵方式制备的苹果醋样品风味特性存在较大差异。适度发酵苹果醋中共检测到37 种挥发性香气成分，完全发酵样品仅检测到22 种，前者芳香风味成分丰富性有明显优势，而且结合实际的感官品评的情况，适度发酵苹果醋在原果香风味成分的保留、特征风味成分种类、相对含量及相互之间的比例等方面比完全发酵的苹果醋更易于形成高质量的产品。

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Analysis of Differences in the Chemical and Aroma Profiles of Apple Vinegar Prepared by Moderate and Entire Fermentation Methods

XUE Shuqin1, XIE Siyun2, XIAO Zijun2, ZHONG Ruimin1,2,*, DENG Zeyuan1, JIANG Qixin2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Yingdong College of Food Science and Technology, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)

The differences in the chemical and aroma profiles of moderately and entirely fermented apple vinegar were investigated. The total phenols content, and organic acid and aroma prof i les were determined and analyzed using Folin-Ciocalteu colorimetry and high performance liquid chromatography (HPLC), respectively. The volatile aroma components were extracted by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The total phenols content in the moderately fermented sample was 21% higher than that in the entirely fermented one. The organic acids species in two vinegar samples were exactly the same, but their contents were different. The moderately fermented vinegar contained higher levels of tartaric acid, citric acid and fumaric acid while the entirely fermented one contained higher levels of pyruvic acid, malic acid, α-ketoglutaric acid, lactic acid, acetic acid and succinic acid. The moderate fermentation could provide the vinegar with more abundant aroma-active compounds. A total of 37 volatile compounds were detected, including citronellol, nerol, butanoic acid ethyl ester, 4-methyl-3-hexyl acetate ester, and 2-methylbutyl acetate, which were also detected in the apple juice. The moderate fermentation method could be an effective way to develop apple vinegar with high quality because of its protective effects on total phenols and aroma compounds.

apple vinegar; moderate fermentation; entire fermentation; total phenol; organic acid; aroma compounds

10.7506/spkx1002-6630-201712021

TS264.22

A

1002-6630（2017）12-0137-07

薛淑琴, 谢思芸, 肖仔君, 等. 完全发酵与适度发酵苹果醋主要成分的差异性分析[J]. 食品科学, 2017, 38(12)： 137-143.

10.7506/spkx1002-6630-201712021. http：//www.spkx.net.cn

XUE Shuqin, XIE Siyun, XIAO Zijun, et al. Analysis of differences in the chemical and aroma profiles of apple vinegar prepared by moderate and entire fermentation methods[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 137-143. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712021. http：//www.spkx.net.cn

2016-09-01

广东省公益研究与能力建设专项（2015A010107018）；国家级大学生创业实践项目（201410576002）

薛淑琴（1989—），女，硕士研究生，主要从事营养与食品卫生研究。E-mail：xsqjybs@163.com

*通信作者：钟瑞敏（1967—），男，教授，博士，主要从事食品低温处理与精深加工研究。E-mail：2557563933@qq.com