补料方式对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响

冯 杰，冯 娜，唐庆九，颜梦秋，杨 焱，周 帅，刘艳芳，刘 方，张劲松*

（农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403）

补料方式对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响

冯 杰，冯 娜，唐庆九，颜梦秋，杨 焱，周 帅，刘艳芳，刘 方，张劲松*

（农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403）

在50 L发酵罐中采用4 种补料培养方式对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜进行比较。结果表明，通过补料可以明显地促进灵芝菌丝体的生长和灵芝三萜的合成，同时，不同的补料方式对菌丝体生长和灵芝三萜合成有不同的影响。采用指数补料方式可获得较高的菌丝体干质量，并提高灵芝三萜含量，与传统的发酵方式相比，采用此补料策略取得了较好的效果。发酵终点灵芝菌丝体干质量达到17.68 g/L，灵芝三萜含量达到4.58 g/100 g干菌丝体，分别比分批发酵提高了65.70%和100.88%。

灵芝；深层发酵；灵芝三萜；补料培养

灵芝（Ganoderma lucidum）作为我国名贵的大型药用真菌，具有滋补、益寿、平衡机体等功效[1-2]。近些年来，随着灵芝功效的进一步发掘，其得到了世界各地许多研究者进一步的深入研究[3-4]。其中，灵芝三萜类化合物在保肝、抗肿瘤、抗蛋白酶活性、抗衰老、抗组织胺释放、降血糖和降血脂等方面具有一定作用[5-6]。

灵芝三萜在现阶段主要有两个来源，一是从人工栽培或野外生长的灵芝子实体和孢子粉中获得，二是从灵芝菌丝体液态深层发酵的产物获得[7-8]。现阶段，灵芝子实体栽培周期长（平均在3 个月以上）、占地大、质量存在不稳定性，严重影响灵芝的研究与相关产品的开发[9-10]。与人工栽培获得灵芝子实体相比较，液态深层发酵技术合成灵芝三萜由于具有菌丝体生长速率快、发酵周期短、不会受到季节性气候的影响、灵芝三萜类化合物活性成分提取与分离比较容易控制等重要特点，因此，通过液态深层发酵技术已成为获得灵芝三萜的有效方法[11-12]。据文献报道，Fang Qinghua等[13-14]对真菌灵芝发酵生产灵芝多糖和菌丝体中灵芝酸（一种灵芝三萜类物质）进行了较为深入的研究，涉及发酵培养基组成、环境因素的优化、发酵动力学研究及流加发酵、两阶段法静置培养等方面。根据他们提出两阶段静置培养模式，即在4 d摇床培养之后再接以12 d的静置培养，灵芝酸质量浓度达到了0.58 g/L，相对连续摇瓶培养7 d的发酵结果有显著提高。Ding Yixin[15]、Ren Ang[16]等在研究中发现通过在培养基中添加植物激素茉莉酸甲酯能够促进灵芝酸的生物合成，灵芝酸含量达到0.45 g/L。目前，灵芝三萜的产量和得率 偏低，导致该方法还不能够完全满足其应用市场的需求。灵芝三萜的低生产率是制约其广泛研发及应用的一个瓶颈[17-18]。

补料培养作为一种介于连续培养和分批培养之间的发酵方式，其培养过程具有富集培养高生物量、缓和培养基底物抑制等 特点，已经被广泛应用到各种发酵初级和次级代谢产物的生产中[19-20]。不同的补料方式对于发酵体系中生物量的提高、底物的利用和产物的合成有一定的促进作用[21]。本研究室前期研究表明，灵芝菌丝体生长和灵芝三萜的合成存在碳源葡萄糖的竞争，故在培 养过程中仅提高菌丝体 浓度并不一定能提高灵芝三萜的得率。基于以上原因分析，本研究通过对4 种补料方式进行比较，考察其对灵芝菌丝 体合成灵芝三萜的影响。并在比较4 种补料培养方式对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜影响的基础上，优化出灵芝三萜高效合成的补料培养策略。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

灵芝菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供和保藏，菌株编号：G. lucidum G0119。

1.1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，购自美国BD公司，称取39 g培养基粉末溶于1 000 mL蒸馏水，在121℃灭菌20 min后备用。

种子培养基：马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth，PDB）培养基，购自美国BD公司，称取24 g培养基粉末溶于1 000 mL蒸馏水，在121℃灭菌20 min后备用。

发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母粉3 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水合硫酸镁2 g/L，调节pH 5.5，121 ℃灭菌25 min后备用。

1.2 仪器与设备

ZWY-2102双层恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；BIOTECH-5BGZ-50JS 50 L发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；Synergy HT多功能酶标仪美国BioT ek公司。

1.3 方法

1.3.1 培养条件

种子液培养：挑取冷冻管保藏的菌种于斜面培养基中，26 ℃培养12 d后，取3 块约0.2 cm2大小的菌块接种于装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上于26 ℃、150 r/min培养10 d得一级种子液。再将培养好的一级种子液以10%（V/V）的接种量，将其接种于装有400 mL种子培养基的1 000 mL三角瓶中，在摇床上于26℃、150 r/min培养7 d得二级种子液。

摇瓶培养：取培养好的一级种子液以10%（V/V）接种量转接于装有200 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，在摇床上于26℃、150 r/min培养至葡萄糖质量分数低于5%时结束发酵。

发酵罐分批培养：培养好的二级种子液以10%（V/V）的接种量，将其接种于含有35 L培养基的50 L发酵罐中，通气比1∶1，26 ℃、100 r/min培养144 h。

1.3.2 补料培养方式

发酵罐间歇式补料培养：培养好的二级种子液以10%的接种量，将其接种于含有35 L培养基的50 L发酵罐中，通气比1∶1，26 ℃、100 r/min培养180 h。在间歇式补料培养过程中，1 000 g/L葡萄糖（总体积为1.05 L）分别于36、78 h和120 h平均分3 次加入发酵罐中。

发酵罐恒速补料培养：培养好的二级种子液以10%的接种量，将其接种于含有35 L培养基的50 L发酵罐中，通气比1∶1，26℃、100 r/min培养180 h。在恒速补料培养过程中，从36 h开始以12.5 mL/h的速率补料1 000 g/L的葡萄糖（补料总体积为1.05 L），至120 h补料结束。

发酵罐变速补料培养：培养好的二级种子液以10%的接种量，将其接种于含有35 L培养基的50 L发酵罐中，通气比1∶1，26℃、100 r/min培养180 h。在变速补料培养过程中，从36 h开始以12.5 mL/h 的速率补料1 000 g/L的葡萄糖（补料体积为525 mL），到78 h后，以25 mL/h的速率补料1 000 g/L的葡萄糖（补料体积为525 mL），至99 h补料结束。

发酵罐指数补料培养：培养好的二级种子液以10%的接种量，将其接种于含有35 L培养基的50 L发酵罐中，通气比1∶1，26℃、100 r/min培养180 h。在指数补料培养过程中，从36 h开始按指数补料方式补料1 000 g/L的葡萄糖（补料总体积为1.05 L），至86 h补料结束。其中，葡萄糖的补料速率F按照（1）式计算[9]。

式中：F为补料速率/（L/h）；μset为菌丝体的平均比生长速率/（1/h）；V0为初始发酵液体积/L；X0为初始菌丝体干质量/（g/L）；Yx/s为菌丝体对葡萄糖得率/（g/g）；Si为补料葡萄糖质量浓度/（g/L）；S为发酵罐内葡萄糖质量浓度/（g/L）。

根据灵芝菌丝体液态深层发酵的数据得到：μset=0.053 1/h[23]，V0=35 L，X0=0.36 g/L[24]，Yx/s=1.084 g/g[17]，Si=1 000 g/L，S=20 g/L。代入数据计算得流速F=6.28×10－4×exp（0.053t），通过蠕动泵控制碳源葡萄糖的流速F。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 菌丝体干质量的测定

取灵芝菌丝体发酵液200 mL在12 000×g离心10 min后丢弃上清液，取沉淀用去离子水洗涤离心3次，收集后放在60 ℃的烘箱中烘干至质量恒定，精确称质量[25-26]。每组实验设定3 个平行，计算平均值。

1.3.3.2 葡萄糖含量的测定

取灵芝菌丝体发酵液200 mL在12 000×g离心10 min后取上清液，将上清液稀释20倍后用3,5-二硝基水杨酸比色法测定葡萄糖质量浓度[27]，葡萄糖终质量浓度的确定以发酵结束时葡萄糖质量浓度基本无变化为准。每组实验设定3个平行，计算平均值，葡萄糖利用率计算如式（2）所示：

1.3.3.3 灵芝三萜含量的测定

干燥的菌丝体用95%乙醇溶液（料液比1∶50（g/mL））浸提24 h后，采用香草醛-冰醋酸比色法[28-29]测定灵芝三萜含量。其中，应用此方法测定的灵芝三萜主要是指三萜类物质或三萜及甾醇的含量。每组实验设定3个平行，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖初始质量浓度对灵芝三萜合成的影响

表1 葡萄糖初始质量浓度对灵芝菌丝体发酵的影响Table1 Effect of initial glucose concentration on mycelial growth and triterpenes production of G. lucidum G0119

灵芝菌丝体作为药用真菌，其菌丝体生长和底物利用相比较于微生物要慢，在灵芝菌丝体培养基中加入过多的葡萄糖会导致其他副产物的形成[30]。以不同葡萄糖初始质量浓度为变量，在摇瓶实验中对灵芝菌丝体液态深层发酵过程中的葡萄糖利用和灵芝三萜合成进行分析，由表1可知，葡萄糖初始质量浓度大于20 g/ L时，对G. lucidum G0119菌丝体生长和灵芝三萜的合成产生较明显的抑制作用。随着葡萄糖初始质量浓度分别增加为25、30 g/L和35 g/L时，灵芝菌丝体干质量分别为11.64、10.65 g/L和9.89 g/L，灵芝三萜含量分别为2.06、1.41 g/100 g干菌丝体和1.26 g/100 g干菌丝体，即葡萄糖初始质量浓度增加时，菌丝体干质量和灵芝三萜含量逐渐降低。当葡萄糖初始质量浓度低于15 g/L时，其菌丝体干质量和灵芝三萜含量随着葡萄糖初始质量浓度的降低而降低。在葡萄糖初始质量浓度为20 g/L时，菌丝体干质量均高于其他葡萄糖初始质量浓度，灵芝三萜含量略低于15 g/L葡萄糖初始质量浓度时的数值，但高于其他葡萄糖初始质量浓度的数值。结合葡萄糖终质量浓度、菌丝体干质量和灵芝三萜含量3 个指标表明G. lucidum G0119培养的葡萄糖初始质量浓度为20 g/L时最适宜。

2.2 灵芝菌丝体液态深层发酵补料时间的确定

图1 50 L发酵罐上灵芝菌丝体 液态深层发酵过程曲线Fig.1 Time course curves for mycelial growth and triterpenes production during submerged culture of G. lucidum G0119 in a 50-L fermentor

以20 g/L葡萄糖作为初始碳源质量浓度，在50 L通风发酵罐上对灵芝菌丝体液态深层发酵的过程进行跟踪分析，根据发酵过程中菌丝体干质量、葡萄糖消耗和灵芝三萜含量参数的变化，绘制发酵过程曲线，结果如图1所示。由图1可知，菌丝体的生长可以分为3个阶段，第1阶段为延滞期，在0～36 h之间，菌丝体基本不生长，葡萄糖质量浓度在36 h时为16.15 g/L，灵芝三萜也没有合成。第2阶段，即对数生长期，在36～120 h之间，在此阶段，菌丝体进入快速生长期，葡萄糖质量浓度快速下降，灵芝三萜含量也同步增加。在菌丝体生长进入第3阶段，即120～144 h时，菌丝体干质量和灵芝三萜含量均达到最大值，分别为10.67 g/L和2.28 g/100 g干菌丝体，同时，葡萄糖质量浓度也达到最低值，为4.5 g/L。对灵芝菌丝体液态深层发酵进行跟踪 分析，可为下一步补料时间的确定提供依据。由图1还可知，灵芝菌丝体在36～120 h进入对数生长期，因此，可以选择在对数生长期的前期、中期和后期，即36、78 h和120 h选择补加葡萄糖。

2.3 间歇式补料培养方式对灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜的影响

图2 间歇式补料葡萄糖对灵芝菌丝体液态深层发酵的影响Fig.2 Effect of intermittent feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

在前期分批发酵研究的基础上进一步提高灵芝三萜的得率，首先考察在50 L发酵罐上间歇式补料培养方式对灵芝三萜发酵的影响。由图2所示，在发酵过程中碳源葡萄糖质量浓度在大部分时间段低于20 g/L，只有在36～48 h由于第1次补料使得葡萄糖质量浓度维持在20 g/L以上，最大葡萄糖质量浓度为26.14 g/L。间歇式补料方式使得葡萄糖的抑制效应变小，最终菌丝体干质量上升到13.68 g/L，比分批发酵方式提高28.21%。灵芝三萜的最终含量为3.63 g/100 g干菌丝体，与分批发酵相比提高59.22%。结果说明间歇式补料培养方式在促进菌丝体生长的同时，菌丝体合成灵芝三萜的效率也有所提高。

2.4 恒速补料培养方式对灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜的影响

采用恒速补料培养方式时，在培养过程中以12.5 mL/h的恒定流速加入葡萄糖，以此解除底物葡萄糖的抑制效应。由图3可以看出，在采用恒速补料培养方式中，灵芝菌丝体生长周期被延长，发酵结束时灵芝菌丝体干质量和产物灵芝三萜含量也相应增加，最终菌丝体干质量达到了14.18 g/L，比分批发酵提高了32.90%，灵芝三萜含量也随之提高至3.03 g/100 g干菌丝体，与分批发酵相比提高32.89%。说明恒速补料培养方式既促进了灵芝菌丝体生长，同时，灵芝菌丝体合成灵芝三萜的得率也有所提高。

图3 恒定速率补料葡萄糖对灵芝菌丝体液态深层发酵的影响Fig.3 Effect of constant feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

2.5 变速补料培养方式对灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜的影响

图4 变速补料葡萄糖对灵芝菌丝体液态深层发酵的影响Fig.4 Effect of variable feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

在恒速补料培养方式下，由于在培养过程中以恒定的12.5 mL/h的流速加入葡萄糖，只较大幅度提高了菌丝体干质量，产物灵芝三萜含量的增加并不明显，因此，考虑采用变速补料的方式来考察灵芝三萜的合成。图4所示为葡萄糖变速补料培养方式下灵芝菌丝体液态深层发酵过程，发酵结束时菌丝体最大干质量达到15.26 g/L，比分批发酵提高了43.02%。灵芝三萜含量达到了3.85 g/100 g干菌丝体，与分批发酵相比 提高68.86%。说明变速补料培养方式在恒速补料培养方式的基础上进一步促进了菌丝体生长和灵芝三萜的合成。

2.6 指数补料培养方式对灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜的影响

在上述恒速补料培养方式中，由于采用了葡萄糖补料速率始终恒定，结果在发酵前期因为菌丝体干质量较低，葡萄糖完全消耗的可能性降低。而在发酵后期，灵芝菌丝体干质量很高，葡萄糖又难以满足灵芝菌丝体生长的需求。因此，根据灵芝菌丝体生长的特点，进一步提出采用指数补料培养方式应有利于菌丝体的生长。由图5分析可知，底物葡萄糖的指数速率补料培养方式对灵芝菌丝体的生长促进效果最好，最终菌丝体干质量的最大值为17.68 g/L，是所有培养方式中的最高水平，比分批发酵提高了65.70%。灵芝三萜的含量也达到最高值，为4.58 g/100 g干菌丝体，比分批发酵提高了100.88%。

图5 指数 速率补料葡萄糖对灵芝菌丝体液态深层发酵的影响Fig.5 Effect of exponential feeding of glucose on mycelial growth and triterpenes production

2.74 种补料培养方式下灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜的比较

表2 各培养方式下发酵参数的比较Table2 Comparison of fermentation parameters with different feeding methods

由表2可知，灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜过程中，4 种葡萄糖补料方式可不同程度地解除葡萄糖对灵芝菌丝体生长的抑制，采用此发酵方式可提高发酵中的菌丝体干质量。同时，这4 种补料培养方式也不同程度地提高了灵芝三萜的合成效率。很显然，指数补料培养方式的效果是最优的，其最终灵芝三萜的含量相比较于分批发酵提高的幅度也是最大的。

3 讨 论

本研究通过采用5 种培养方式研究灵芝菌丝体液态深层发酵对合成灵芝三萜的影响。实验结果表明，灵芝菌丝体合成灵芝三萜的过程为生长偶联型，由表2恒速补料培养结果可知，菌丝体干质量与灵芝三萜的含量并不是正比关系。因此，在灵芝菌丝体生长和灵芝三萜合成之间达到平衡对于灵芝三萜的高产有重要意义。本研究比较的5 种灵芝菌丝体的培养方式中，分批培养由于没有补料葡萄糖，使得发酵后期葡萄糖质量浓度处于低水平，最终菌丝体干质量和灵芝三萜含量均比较低；间歇式补料培养改善了发酵培养基中的营养条件，使得菌丝体干质量和灵芝三萜含量均有所提高，但是由于在36 h补料时导致一段时间内葡萄糖质量浓度过高，未能使得菌丝体发酵达到最优化条件。恒速补料培养方式改善了灵芝菌丝体在发酵后期的葡萄糖条件，使得灵芝菌丝体干质量和灵芝三萜含量均有所增加，但是在整个培养过程中只是采用恒定的补料速率，会使发酵前期葡萄糖含量过高，而在发酵后期葡萄糖含量又在较低水平，因此，该培养方式在一定程度上也限制了灵芝菌丝体干质量和灵芝三萜含量的增加。变速补料方式在恒速补料的基础上有所改进，但是依然很难弥补灵芝菌丝体在发酵后期葡萄糖不足的缺点。对于指数补料方式，由于该培养方式是基于菌丝体指数生长理论而推导出的一种方法，在发酵前期，灵芝菌丝体干质量偏低，因而补料葡萄糖的含量也比较少，在整个发酵过程中，随着灵芝菌丝体干质量的指数增加，补料葡萄糖速率也根据指数方式增加，结果使得葡萄糖的补料方式能更适合灵芝菌丝体的生长和灵芝三萜的合成，特别是发酵后期为菌丝体合成灵芝三萜的重要阶段，这时大量的补料葡萄糖既适合菌丝体的生长也促进了灵芝三萜的大量合成。因此，通过比较分批培养和其他4 种补料培养方式可知，采用指数补料培养方式可较大幅度地提高灵芝菌丝体干质量和灵芝三萜含量。

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Effects of Different Feeding Methods on Production of Triterpenes by Ganoderma lucidum in Submerged Fermentation

FENG Jie, FENG Na, TANG Qingjiu, YAN Mengqiu, YANG Yan, ZHOU Shuai, LIU Yanfang, LIU Fang, ZHANG Jingsong*
(Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South), Ministry of Agriculture, National Engineering Research Center of Edible Fungi, Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai, Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China)

Four different feeding methods for the production of triterpenes by submerged fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum G0119 in a 50 L-fermentor were compared. The results showed that glucose feeding during fermentation could obviously promote the mycelical growth of G. lucidum G0119 and the synthesis of triterpenes, and different feeding methods had different influences on the mycelial dry weight and the concentration of triterpenes in the fermentation broth. The highest mycelical dry weight could be obtained by exponential feeding, as well as high concentration of triterpenes. The results showed that the feeding strategy was the best among all tested ones, giving a mycelial dry weight of 17.68 g/L and a triterpene content of 4.58 g/100 g dry mycelium at the end of fermentation, which were significantly increased by 65.70% and 100.88%, respectively, as compared with fed-batch fermentation.

Ganoderma lucidum; submerged culture; triterpenes; fed-batch culture

10.7506/spkx1002-6630-201712009

TQ920.6

A

1002-6630（2017）12-0057-06

冯杰, 冯娜, 唐庆九, 等. 补料方式对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响[J]. 食品科学, 2017, 38(12)： 57-62.

10.7506/spkx1002-6630-201712009. http：//www.spkx.net.cn

FENG Jie, FENG Na, TANG Qingjiu, et al. Effects of different feeding methods on production of triterpenes by Ganoderma lucidum in submerged fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 57-62. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712009. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-18

上海市市级农口系统青年人才成长计划资助项目（沪农青字2015第1-7号）；上海市农业科学院青年科技人员“助跑”计划项目（ZP06）

冯杰（1983—），男，副研究员，博士，研究方向为食药用菌液态深层发酵。E-mail：sytufengjie@163.com

*通信作者：张劲松（1969—），男，研究员，博士，研究方向为食药用菌中活性物质的化学结构及药理活性。E-mail：syja16@saas.sh.cn