有机干扰物对超氧化电位水杀菌效果影响研究

陈红运，宋全厚，2，*，尹建军，2，侯玉柱，2，刘秀，2

（1.中国食品发酵工业研究院，北京100027；2.国家食品质量监督检验中心，北京100027）

有机干扰物对超氧化电位水杀菌效果影响研究

陈红运1，宋全厚1，2，*，尹建军1，2，侯玉柱1，2，刘秀1，2

（1.中国食品发酵工业研究院，北京100027；2.国家食品质量监督检验中心，北京100027）

试验以牛血清白蛋白（BSA）为有机干扰物质，大肠杆菌为灭菌对象，通过悬液定量杀菌试验和理化分析方法研究有机干扰物质对超氧化电位水（NEOW）杀菌效果影响。试验结果显示：在不含有机干扰物时，NEOW作用30s，能够将菌落数对数值为7.76的大肠杆菌完全杀灭。用无菌水对NEOW稀释后，pH和氧化还原电位（ORP）变化不明显，有效氯浓度（ACC）随着稀释度的增加而降低，但稀释至60%时同样保持快速杀灭能力。在干扰物作用下，随着BSA浓度增加，NEOW杀菌效果降低。但NEOW在低浓度BSA的干扰下，可以通过增加杀菌时间或者增加有效氯浓度达到杀菌效果；在高浓度BSA的干扰下，需要对消毒环境进行预先清洗降低干扰物的量再进行消毒。

有机干扰物；大肠杆菌；超氧化电位水；杀菌效果

氧化电位水具有快速、广谱杀菌效果以及低残留、无毒副作用等正越来越多在农业、生活中得到应用[1-7]。然而在实际消毒过程中，消毒对象表面往往含有较多油脂、蛋白质以及产品碎片等有机物，有文献表明这些物质会降低氧化电位水的杀菌效果[8-10]。2002年版《消毒技术规范》[11]以及GB28234-2011《酸性氧化电位水生成器安全与卫生标准》[12]规定在研究消毒剂的杀菌效果时，使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为有机干扰物，以其浓度的大小作为代表消毒对象的清洁状况。因此实验以大肠杆菌为灭菌对象，以牛血清白蛋白为有机干扰物质，研究清洁条件（无干扰物）及不同浓度有机干扰物对发酵院自行研制的超氧化电位水生成装置制备的电位水杀菌效果的影响，同时研究不同种类物质对超氧化电位水理化特性的影响，为其实际应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无水乙醇，山东利尔康医疗科技股份有限公司；氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、硫代硫酸钠，北京化工厂；营养琼脂、胰蛋白胨、吐温80，北京路桥技术有限责任公司；牛血清白蛋白、聚醚砜滤膜（孔径0.22 μm），北京博奥拓达科技有限公司。

1.2 试验指示菌

大肠杆菌（CICC10389），购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.3 仪器与设备

超氧化电位水生成器：中国食品发酵工业研究院自行研制；双路pH/ORP控制器：杭州联测自动化技术有限公司；消毒液有效氯检验试纸：广州达元绿洲食品安全科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 NEOW的制备

NEOW生成器在电解电流40A、出水流量500L/h、无隔膜电解槽条件下电解质量分数0.1%的NaCl溶液，制备得到NEOW。用双路pH/ORP控制器测定其pH值和氧化还原电位（oxidation reduction potential，ORP），用消毒液有效氯检验试纸测定其有效氯浓度（available chlorine concentration，ACC）。

1.4.2 0.22 μm的聚醚砜滤膜过滤BSA

由于BSA是一种蛋白质，其溶液不能高压灭菌，实验采用0.22μm的聚醚砜滤膜对配制的BSA进行过滤，用紫外分光光度法测定过滤后BSA浓度[13]，同时按GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》方法观察过滤后的样液是否含有杂菌[14]。

1.4.3 中和剂鉴定试验

在评价NEOW的杀菌效果时，作用到规定时间后必须终止残留NEOW的消毒作用，因此需要选择适当的中和剂。试验选择中和剂组成为0.8%的硫代硫酸钠+0.5%的吐温80的磷酸盐缓冲液（pH7.2～7.4），鉴定程序按照2002年版《消毒技术规范》中2.1.1.5.5步骤进行，设计6组，评价标准为第一组无菌生长或少于第二组；第二组菌数远小于第三、四、五组；第三、四、五组间菌数误差不超过15%；第六组无菌生长。

1.4.4 悬液定量杀菌试验

将试管斜面保存的大肠杆菌接种到营养琼脂平板上，37℃培养18 h～24 h，然后用10 mL胰蛋白胨生理盐水（TPS）洗下菌苔，经过10倍稀释后得到浓度为1×107cfu/mL～9×107cfu/mL的菌悬液。将NEOW与无菌蒸馏水以体积比混合均匀，得到80%、60%、40%的稀释液，然后参照2002版《消毒技术规范》2.1.1.7.4对大肠杆菌进行悬液定量杀菌操作。BSA对NEOW影响试验，是将菌悬液与BSA对倍稀释后代替原始菌悬液，然后按照上述步骤进行。作用完成后以GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》法测定样液残留的细菌总数，然后计算灭菌对数值（对照组平均活菌浓度的对数值-试验组活菌浓度对数值）。

1.4.5 统计学处理

采用SPSS16.0统计软件对数据进行处理，试验结果以均值±标准偏差（a±SD）表示，采用组间t检验，P< 0.05具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 聚醚砜滤膜对BSA过滤结果

孔径为 0.22 μm聚醚砜滤膜对 3、5、10 mg/mL BSA过滤结果见表1。

表1 孔径为0.22 μm聚醚砜滤膜对3、5、10 mg/mL BSA过滤结果Table 1 Results of 3，5，10 mg/mL BSA filtration with a pore size of 0.22 μm PES membrane

由表1可见，孔径为0.22 μm聚醚砜滤膜对BSA过滤后，其浓度分别从3、5、10 mg/mL，上升为3.27、5.30、11.00 mg/mL，变化不显著（P＞0.05）且滤液不含杂菌，因此孔径为0.22 μm聚醚砜滤膜适合对BSA进行过滤。

2.2 中和剂鉴定试验

中和剂鉴定结果见表2。

表2 中和剂鉴定结果Table 2 The result of verification test for neutralizer

由表2可见，第一组菌落数远少于第二组，第三、四、五组组间误差率为9.25%<15%。因此0.8%的硫代硫酸钠+0.5%的吐温80的磷酸盐缓冲液（pH7.2～7.4）能够有效中和NEOW原液对大肠杆菌的灭菌作用，并且中和剂、中和产物对大肠杆菌的生长无显著影响（P>0.05），符合2002年版《消毒技术规范》要求。

2.3 在清洁条件下，不同稀释度NEOW对大肠杆菌杀灭效果

用无菌水将NEOW以体积比分别稀释至80%、60%、40%，然后对不同稀释度NEOW按照1.4.4悬液定量杀菌步骤进行，理化指标及杀菌效果见表3。

表3 NEOW不同稀释度理化指标变化及杀菌效果Table 3 Changes of physical and chemical indexes of different dilution degree and germicidal efficacy of NEOW

由表3可知：NEOW在40%稀释范围内，ORP和pH变化不明显，ACC随着稀释倍数的增加而降低。NEOW原液在60%稀释度内，作用30 s可将大肠杆菌完全杀灭。稀释至40%时，尽管NEOW保持高ORP值，但灭菌对数值仅为1.95，远低于其他稀释度杀菌效果；但将NEOW使用量提升至9 mL后，在30 s内也能将大肠杆菌完全杀灭（结果没有显示）。由此可见，NEOW对大肠杆菌杀灭能力极强，但在低有效氯条件下，仅靠高ORP不能发挥快速杀菌作用，需要增加电位水的使用量或者提高有效氯浓度达到快速的杀菌效果。

2.4 BSA对NEOW杀菌效果影响

3 mg/mLBSA对不同稀释度超氧化电位杀菌效果影响见表4。

表4 3 mg/mL BSA对不同稀释度超氧化电位杀菌效果Table 4 Under 3 mg/mL BSA，germicidal efficacy of different dilution degree of NEOW

由表4可知，在3 mg/mLBSA干扰下，随着稀释倍数的增加，在相同时间内灭菌效果逐渐降低，但在相同稀释度时，随着时间的延长，杀菌效果增强；NEOW原液作用3 min及80%稀释范围内作用5 min即可达到杀菌效果。5 mg/mL和10mg/mLBSA对超氧化电位原液杀菌效果影响见表5。

表5 5 mg/mL和10 mg/mLBSA对超氧化电位原液杀菌效果Table 5 Under 5 mg/mL and 10 mg/mL BSA，germicidal efficacy of NEOW

由表5可知，随着BSA浓度增加，NEOW杀菌效果显著减低，在5 mg/mLBSA干扰下，NEOW原液作用时间需提高到20 min才能达到杀菌效果，而在10 mg/mL BSA干扰下杀菌效果较差。与表3中不含BSA杀菌效果比较，BSA能够干扰NEOW的杀菌能力，但在低浓度BSA的干扰下，可以通过增加杀菌时间或者增加有效氯浓度达到杀菌效果。但在高浓度BSA的干扰下，需要对消毒环境进行预先清洗降低干扰物的量从而达到杀菌效果。

2.5 BSA对NEOW理化指标影响

为研究BSA降低NEOW消毒效果的机理，将无菌BSA和NEOW原液混合，搅拌混匀后测定其pH、ACC、ORP。结果见表6。

表6 BSA对NEOW理化指标影响Table 6 Changes of physical and chemical indexes of NEOW of BSA

由表6可知：在不含菌悬液条件下，其ACC和ORP急剧下降，并且BSA浓度越高，下降越显著；而pH基本无变化。3 mg/mL BSA时，ACC浓度由50 mg/L下降到20 mg/L，ORP由799 mV下降到472 mV。将BSA提升至10 mg/mL后，ACC仅为5 mg/L，ORP为307 mV。表明BSA能够与NEOW的有效杀菌成分反应，使ACC和ORP值大幅度下降，导致NEOW杀菌效果显著降低。

2.6 其他物质对NEOW理化指标影响

消毒环境中往往含有多种杂质，可能会改变NEOW的理化特性进而影响消毒效果，因此研究不同物质对NEOW的理化指标影响，结果见表7。

表7 不同物质对NEOW理化指标影响Table 7 Changes of physical and chemical indexes of NEOW of different substances

由表7可知，蛋白质、氨基酸、维生素类能够将NEOW的ORP和ACC大幅度降低，进而降低杀菌效果；有机酸、碳水化合物、油脂对ORP和ACC的影响较小；矿物质类中具有还原性的物质如硫酸亚铁能够将有效氯还原、强氧化物质如重铬酸钾能够将有效氯氧化而使ORP、ACC、pH变化较大，而中性的硫酸镁对理化特性影响较小。不同物质对NEOW的理化特性影响不同，因此在实际消毒时，可根据消毒环境干扰物的种类及所占比例选择适宜浓度和使用量的NEOW。

3 结论

曾新平[15]，Eun-JinPark[16]，VicenteM[17]等学者很早对BSA对氧化电位水的杀菌效果进行研究，但其研究只是针对酸性氧化电位水，也没有进一步研究有机物及各种物质对NEOW理化特性影响。本实验按照2002年版《消毒技术规范》研究有机物对NEOW杀菌效果影响，试验结果表明在不含有机干扰物时，发酵院自行研制的NEOW具有快速灭菌能力。NEOW可以通过增加杀菌时间或者有效氯浓度抵抗低浓度的BSA干扰。但在高浓度BSA的干扰下，需要对消毒环境进行预先清洗降低干扰物的量从而达到杀菌效果。不同种类物质对NEOW的3个关键指标pH、ACC、ORP的影响不同，因此可根据消毒环境干扰物的种类及所占比例选择适宜浓度和使用量的NEOW。本研究对超氧化电位水在实际应用时具有指导意义。

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Study on the Influence of Organic Interfering Substance on Germicidal Efficacy of Neutral Electrolyzed Oxidizing Water

CHEN Hong-yun1，SONG Quan-hou1，2，*，YIN Jian-jun1，2，HOU Yu-zhu1，2，LIU Xiu1，2
（1.China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100027，China；2.National Center for Food Quality Supervision and Testing，Beijing 100027，China）

Bovine serum albumin（BSA）was as organic interfering substances，Escherichia coli was for sterilization object in the laboratory.Suspension quantitative germicidal test and physicochemical analysis method were carried out to observe the influence of organic interfering substance on germicidal efficacy of neutral electrolyzed oxidizing water（NEOW）.The results showed that when without organic interfering substances，the killing logartithm of Escherichia coli exposed to the NEOW for 30 s was 7.76.pH and oxidation reduction potential（ORP）changesd were not obvious after dilution of NEOW.Available chlori-ne concentration（ACC）decreased as dilution，however，the 60%of dilution of NEOW maintained same germicidal efficacy.Germicidal efficacy of NEOW was significantly reduced as the BSA concentration increased.But germicidal efficacy of NEOW could be available by increasing time or ACC at low conce-ntrations of BSA，it need to be cleaned to reduce the amount of organic interfering substances and then disinfected at high concentrations of BSA.

organic interfering substance；Escherichia coli；neutral electrolyzed oxidizing water；germicidal efficacy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.041

2016-12-01

国家重点研发计划生物安全重点专项（2016YFC1201504）作者简介：陈红运（1987—），男（汉），硕士研究生，研究方向：超氧化电位水消毒技术的研究与应用。

*通信作者：宋全厚，教授级高级工程师，研究方向：长期从事食品质量安全技术研发管理工作。